High performance liquid chromatography (HPLC) is currently the most widely used analytical separation technique. Unfortunately, the efficiency is usually smaller than that achieved in gas chromatography, capillary electrophoresis and other electromigration techniques. This constrains the analysis of complex samples. Hence, the high effort dedicated to increase the efficiency and selectivity in HPLC, with significant improvements since the beginning of the technique. Despite the progress in the last decades, with the development of increasingly more sophisticated instrumentation (including the introduction of ultra-high pressure pumps), and the advances in column technology (with the synthesis of new supports and stationary phases), there are still challenges to solve. The PhD. work collected in this Project gathers some proposals of two types to improve the HPLC performance: 1. Increasing the modelling capability in liquid chromatography Interpretive optimisation strategies are based on the accurate description of the chromatographic behaviour (retention and peak profiles), using mathematical models. The predictive capability of the fitted models will depend on the quality of the information provided by the experimental design. Isocratic experiments are maximally informative, but they suffer from the important drawback of needing a long time for data acquisition, and are unpractical for highly hydrophobic solutes. For this reason, the use of gradient experimental designs are recommended. In the PhD. Project, several studies are presented which have deepened on the analysis of experimental designs to enhance the prediction capability of retention models, as well as the proposal of new models to optimise the resolution in the presence of additives. The following objectives were addressed: • Investigate the application of interpretive optimisation strategies in nano-liquid chromatography using polymeric monolithic columns, and evaluate the chromatographic behaviour with different stationary phases prepared in the laboratory. • Evaluate the predictive capability of diverse experimental designs and retention models, based on the quality information provided by isocratic, gradient and mixed experiments. • Analyse the potential of isocratic runs including transient increments of organic solvent (pulses) with modelling purposes. • Design a new methodology for the estimation of the peak capacity, based on a reliable peak simulation, valid for a variety of situations including extra-column contributions, formation of asymmetrical peaks and the use of multi-linear gradients. • Adapt interpretive optimisation strategies in micellar liquid chromatography. A particular interest is on the development of new retention models that describe the chromatographic behaviour in extended organic solvent domains, and the optimisation of the elution conditions for the analysis of physiological fluids under isocratic and gradient elution. 2. Improving the separation performance in chromatographic fingerprints The resolution of complex samples containing unknown compounds of different nature, or without standards, as is the case of chromatographic fingerprints, is still a challenge. Usually, samples with similar fingerprints also have similar properties. Therefore, this type of chromatogram has a potential interest to determine the identity, authenticity and consistency between batches of natural products of diverse nature. Strategies that allow obtaining fingerprints as rich in information as possible are still neeeded. For this purpose, tools to process properly complex chromatograms and improve the separation performance should be developed. The following objectives were addressed: • Progress in the data pre-processing of chromatographic fingerprints of natural products, with a particular interest in baseline subtraction for highly complex samples, with little supervision. • Develop a chromatographic objective function valid to measure the separation quality when there are no standards available. • Improve the analysis of natural products, obtaining informative chromatographic fingerprints by comprehensive two-dimensional liquid chromatography. The work has implied a large experimental effort, designed to explore and extract information on the chromatographic behaviour of families of compounds of different nature. A great diversity of experimental conditions using aqueous-organic mobile phases with acetonitrile and methanol, and pure and hybrid micellar mobile phases, have been used along the studies. The work has implied an extensive data treatment, mainly related with the construction of models to predict the chromatographic retention, peak shape and resolution of mixtures of compounds, with optimisation purposes. The large effort in several literature surveys on the different topics investigated in this work should be also highlighted. This has implied the search, reading and organisation of a large amount of valuable information that is properly reflected in each part of the PhD. Project.La cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography, HPLC) es actualmente la técnica de separación analítica más utilizada. Desafortunadamente, la eficacia suele ser menor que la obtenida en cromatografía de gases, electroforesis capilar y otras técnicas de electromigración. Esto limita el análisis de muestras complejas. De ahí el elevado esfuerzo dedicado a incrementar la eficacia y la selectividad en HPLC, con importantes mejoras desde el inicio de la técnica. A pesar de los avances en las últimas décadas, con el desarrollo de instrumentación cada vez más sofisticada (incluida la introducción de bombas de ultra-alta presión), y los avances en la tecnología de columnas (con la síntesis de nuevos soportes y fases estacionarias), aún existen desafíos por resolver. El trabajo realizado a lo largo de la Tesis Doctoral recoge algunas propuestas para mejorar el rendimiento de HPLC, que se presentan en dos grandes apartados: 1. Aumento de la capacidad de modelado en cromatografía líquida Las estrategias de optimización interpretativa se basan en la descripción exacta del comportamiento cromatográfico (retención y perfiles de pico), utilizando modelos matemáticos. La capacidad predictiva de los modelos ajustados dependerá de la calidad de la información proporcionada por el diseño experimental. Los experimentos isocráticos proporcionan la mayor calidad informativa, pero presentan el importante inconveniente de necesitar mucho tiempo para la adquisición de datos, y no son prácticos para solutos altamente hidrófobicos. Por esta razón, se recomienda el uso de diseños experimentales en gradiente. La Memoria de Tesis Doctoral recoge varios estudios que han profundizado en el análisis de los diseños experimentales para mejorar la capacidad de predicción de los modelos de retención, así como la propuesta de nuevos modelos para optimizar la resolución en presencia de aditivos. Se abordaron los siguientes objetivos: • Investigar la aplicación de las estrategias de optimización interpretativa en nano-cromatografía líquida utilizando columnas monolíticas poliméricas, y evaluar el comportamiento cromatográfico con diferentes fases estacionarias preparadas en el laboratorio. • Evaluar la capacidad predictiva de diversos diseños experimentales y modelos de retención, en base a la calidad de la información proporcionada por experimentos isocráticos, de gradiente y mixtos. • Analizar el potencial de experimentos isocráticos que incluyan incrementos transitorios de disolvente orgánico (pulsos) con propósitos de modelización. • Diseñar una nueva metodología para la estimación de la capacidad de pico, basada en la simulación fiable de picos cromatográficos, válida para una variedad de situaciones que incluye las contribuciones extra-columnares, la formación de picos asimétricos y el uso de gradientes multi-lineales. • Adaptar las estrategias de optimización interpretativa a cromatografía líquida micelar. Un interés particular es el desarrollo de nuevos modelos de retención que describen el comportamiento cromatográfico en dominios extendidos de disolvente orgánico, y la optimización de las condiciones de elución para el análisis de fluidos fisiológicos con elución isocrática y de gradiente. 2. Mejora del rendimiento de separación de huellas dactilares cromatográficas La resolución de muestras complejas que contienen compuestos desconocidos de diferente naturaleza, o de los que no se posee estándares, como es el caso de las huellas cromatográficas, sigue siendo un desafío. Por lo general, las muestras con huellas dactilares similares también tienen propiedades similares. Por tanto, este tipo de cromatograma tiene un interés potencial para determinar la identidad, autenticidad y consistencia entre lotes de productos naturales de diversa naturaleza. Aún se necesitan estrategias que permitan obtener huellas dactilares tan ricas en información como sea posible. Para ello, se deben desarrollar herramientas para procesar correctamente cromatogramas complejos y mejorar el rendimiento de la separación. Se abordaron los siguientes objetivos: • Avances en el pre-procesamiento de datos de huellas cromatográficas de productos naturales, con un particular interés en la sustracción de líneas base de muestras muy complejas, con poca supervisión. • Desarrollar una función objetivo cromatográfica válida para medir la calidad de la separación cuando no existen estándares disponibles. • Mejorar el análisis de productos naturales, obteniendo huellas dactilares cromatográficas informativas mediante cromatografía líquida bidimensional integral. El trabajo ha implicado un gran esfuerzo experimental, diseñado para explorar y extraer información sobre el comportamiento cromatográfico de familias de compuestos de diferente naturaleza. A lo largo de los estudios, se han utilizado una gran diversidad de condiciones experimentales utilizando fases móviles acuo-orgánicas con acetonitrilo y metanol, y fases móviles micelares puras e híbridas. El trabajo ha implicado un extenso tratamiento de datos, principalmente relacionados con la construcción de modelos para predecir la retención cromatográfica, forma de pico y resolución de mezclas de compuestos, con fines de optimización. También cabe destacar el gran esfuerzo en la realización de búsquedas bibliográficas sobre los diferentes temas investigados a lo largo del trabajo de Tesis Doctoral. Ello ha implicado la búsqueda, lectura y organización de una gran cantidad de información valiosa que se refleja adecuadamente en cada apartado de la Memoria.