Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NOS) presentan un destacado interés para diversos contextos de la medicina experimental y clínica. Ambas especies desempeñan una doble función en los sistemas biológicos aerobios, ya que favorecen tanto procesos metabólicos como celulares, mientras que, dada su acción oxidante, han sido asociadas con numerosas enfermedades, así como con el proceso de envejecimiento. A pesar de la poderosa y compleja maquinaria antioxidante de los organismos superiores, cuando la capacidad de estos mecanismos protectores es superada por la intensidad o duración de los procesos oxidativos, se produce una situación denominada estrés oxidativo, que se define como una alteración en el equilibrio entre la producción de ROS y las defensas antioxidantes, produciendo daño oxidativo. El estudio experimental de la actividad y el estrés oxidativo es un aspecto complicado debido a la complejidad de los procesos bioquímicos implicados y por la limitada vida media de las diferentes ROS y RNS que participan en los mismos. La citometría de flujo (CMF) se utiliza con gran frecuencia para el estudio cuantitativo de la generación intracelular de ROS y RNS gracias a la disponibilidad de diversos tipos de sustratos fluorogénicos y fluorocromos. El uso de sondas fluorescentes parece un enfoque simple y fácil para la detección y cuantificación de la producción de ROS y RNS en sistemas celulares. Sin embargo, hay muchas limitaciones y artefactos en esta metodología. Es por ello, que el objetivo principal del presente estudio es evaluar los problemas de especificidad de las sondas fluorescentes y la participación de diferentes ROS en diversas condiciones de estrés oxidativo. Los estudios citómicos se han desarrollado sobre células eucariotas (líneas celulares Jurkat y N13) y células procariotas (cepas de Escherichia coli B deficientes en la defensa antioxidante) con diferentes sustratos fluorogénicos y combinaciones de estos. Para ello se emplean diversos xenobióticos generadores de ROS y RNS. Se desarrollan ensayos por CMF que permiten detectar e interpretar posibles interferencias entre sustratos fluorogénicos y de los sustratos fluorogénicos con el sistema biológico que pueden limitar la aplicabilidad de ensayos multiparamétricos de estrés. Además, para abordar fenómenos temporales relacionados con la generación de ROS y RNS, se emplea la CMF en tiempo real. Se presenta un estudio en el que ha sido posible diseñar y desarrollar en diferentes modelos experimentales, ensayos por CMF que permiten medir la generación de ROS y RNS con diferentes sustratos fluorogénicos en suspensiones celulares tratadas con diversos xenobióticos. Ello nos ha permitido evaluar de forma objetiva las ventajas y limitaciones de una serie de sondas fluorescentes de relevancia en estudios experimentales de estrés oxidativo o nitrosativo. Aunque existen discrepancias en los ensayos multiparamétricos se propone una serie de recomendaciones para el diseño de paneles por CMF de estrés oxidativo.Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (NOS) are of outstanding interest in various areas of experimental and clinical medicine. Both species have a dual role in aerobic biological systems, supporting both metabolic and cellular processes, while, given their oxidative action, they have been associated with numerous diseases, as well as with the ageing process. Despite the powerful and complex antioxidant machinery of higher organisms, when the capacity of these protective mechanisms is exceeded by the intensity or duration of oxidative processes, a condition known as oxidative stress occurs, which is defined as an alteration in the balance between ROS production and antioxidant defences, causing oxidative damage. The experimental study of oxidative stress and activity is complicated by the complexity of the biochemical processes involved and by the limited half-life of the different ROS and RNS that are involved. Flow cytometry is widely used for the quantitative study of intracellular generation of ROS and RNS due to the availability of various types of fluorogenic substrates and fluorochromes. The use of fluorescent probes is a simple and easy approach for the detection and quantification of ROS and RNS production in cellular systems. However, there are many limitations and artefacts in this methodology. Therefore, the main objective of the present study is to evaluate the specificity issues of fluorescent probes and the involvement of different ROS in various oxidative stress conditions. Cytomics studies have been performed on eukaryotic cells (Jurkat and N13 cell lines) and prokaryotic cells (Escherichia coli B strains deficient in antioxidant defence) with different fluorogenic substrates and combinations of these. Various ROS- and RNS-generating xenobiotics are used for this approach. Flow cytometry assays are developed to detect and interpret possible interferences between fluorogenic substrates and of the fluorogenic substrates with the biological system that may limit the applicability of multi-parametric stress assays. In addition, real-time flow cytometry is used to investigate temporal phenomena related to the generation of ROS and RNS. We present a study in which it has been possible to design and develop, in different experimental models, flow cytometry assays to measure the generation of ROS and RNS with different fluorogenic substrates in cell suspensions treated with different xenobiotics. This has allowed us to objectively assess the advantages and limitations of several fluorescent probes of relevance in experimental studies of oxidative or nitrosative stress. Although discrepancies exist in multi-parametric assays, a guideline for the design of flow cytometry panels for oxidative stress is proposed.