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Efecto de la hipoxia en la degranulación, producción de citoquinas y perfil oxidativo de neutrófilos en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina

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Efecto de la hipoxia en la degranulación, producción de citoquinas y perfil oxidativo de neutrófilos en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina

dc.contributor.advisor	Dasí Fernández, Francisco
dc.contributor.author	Magallón Serrano, María
dc.contributor.other	Departament de Fisiologia	es_ES
dc.date.accessioned	2022-12-09T09:44:51Z
dc.date.available	2023-01-09T05:45:06Z
dc.date.issued	2022	es_ES
dc.date.submitted	16-12-2022	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10550/84705
dc.description.abstract	Introducción. El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una condición genética rara que se caracteriza por unos niveles séricos bajos de la proteína (AAT), lo que puede provocar enfermedad pulmonar y/o hepática. Esta provocado por mutaciones en el gen SERPINA1 siendo M la variante alélica que da lugar a la proteína funcional, mientras que S y Z son las mutaciones más comunes asociadas a esta condición. Es considerado un trastorno proinflamatorio en el que los neutrófilos, aumentados en los pulmones de estos pacientes, juegan un papel crucial. La habilidad de los neutrófilos de dañar los tejidos adyacentes depende de su estado de activación. Una excesiva activación conduce a su degranulación, y por consiguiente liberación de proteasas, liberación de citoquinas proinflamatorias y producción de especies reactivas, lo que contribuye al daño tisular. Los neutrófilos, así como otras células del sistema inmunitario, ejercen su función en focos de infección y/o inflamación donde trabajan a concentraciones de oxígeno bajas. Objetivo. Evaluar el efecto de la hipoxia sobre la activación de los neutrófilos en pacientes con DAAT, así como determinar si la terapia de reposición reduce su activación. Metodología. Se aislaron neutrófilos a partir de sangre periférica de los sujetos de estudio mediante selección inmunomagnética negativa y se cultivaron, bajo condiciones de hipoxia (1% O2) o bajo normoxia (21% O2) durante 4 horas a 37°C. Tras ello, se estimularon y activaron con TNF-α (20 ng/ml, 30 min) y fMLP (100 nM, 10 min). Posteriormente, se determinó la viabilidad celular y parámetros de degranulación, producción y liberación de citoquinas y perfil oxidativo. Resultados. Los neutrófilos procedentes de niños ZZ asintomáticos, bajo condiciones de hipoxia, presentan una mayor degranulación (gránulos primarios, secundarios y terciarios), un incremento en la producción de ONOO-, H2O2, NO e IL-8, respecto a los neutrófilos MM. La expresión de catalasa se encuentra reducida en los niños ZZ asintomáticos lo que explicaría la acumulación de H2O2. Además, existe un daño oxidativo incrementado en los lípidos (ZZ) y en las proteínas (MZ, SZ y ZZ). Los neutrófilos de pacientes ZZ con EPOC, incubados en hipoxia, presentan un incremento en la liberación de los gránulos primarios (MPO) y mayor daño oxidativo en las proteínas. La hipoxia aumenta la liberación de los gránulos primarios (MPO), IL-8 y H2O2 en los neutrófilos de niños ZZ asintomáticos respecto a normoxia. Además, la hipoxia produce mayor efecto en la liberación de AAT en los pacientes con DAAT, tanto niños como adultos, que en los individuos sanos, lo cual sugiere un mecanismo de defensa frente al DAAT. Conclusiones. La hipoxia induce un fenotipo más agresivo en los neutrófilos de pacientes DAAT con un incremento en su habilidad para liberar los gránulos de proteínas, producción y liberación de citoquinas proinflamatorias y de especies reactivas, agravando el daño tisular en los pacientes con DAAT.	es_ES
dc.description.abstract	Introduction. Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare genetic condition characterized by low serum levels of the protein (AAT), which can lead to lung and/or liver disease. It is caused by mutations in the SERPINA1 gene, with M being the allelic variant that codifies the functional protein, while S and Z are the most common mutations associated with this condition. It is considered a proinflammatory disorder in which neutrophils, increased in the lungs of these patients, play a crucial role. The ability of neutrophils to damage adjacent tissues depends on their activation state. Excessive activation leads to its degranulation, and consequently release of proteases, proinflammatory cytokines, and the production of reactive species, which contributes to tissue damage. Neutrophils, as well as other cells of the immune system, exert their function in infection and/or inflammation foci where they work at low oxygen concentrations. Objective. To evaluate the effect of hypoxia on the activation of neutrophils in patients with AATD, as well as to determine if replacement therapy reduces their activation. Methodology. Neutrophils were isolated from the peripheral blood of the study subjects by negative immunomagnetic selection and cultured under hypoxic (1% O2) or normoxic (21% O2) conditions for 4 hours at 37°C. After that, they were stimulated and activated with TNF-α (20 ng/ml, 30 min) and fMLP (100 nM, 10 min). Subsequently, cell viability, degranulation, production and release of cytokines, and oxidative profile parameters were determined. Results. Neutrophils from asymptomatic ZZ children, under hypoxic conditions, show greater degranulation (primary, secondary and tertiary granules), and an increase in the production of ONOO-, H2O2, NO, and IL-8, compared to MM neutrophils. Catalase expression is reduced in asymptomatic ZZ children, which would explain the accumulation of H2O2 in these patients. In addition, there is an increase in oxidative damage in the lipids (ZZ) and proteins (MZ, SZ, and ZZ). Neutrophils from ZZ patients with COPD, incubated in hypoxia, show an increase in the release of primary granules (MPO) and greater oxidative damage in the proteins. Hypoxia increases the release of primary granules (MPO), IL-8, and H2O2 in neutrophils of asymptomatic ZZ children relative to normoxia. In addition, hypoxia has a greater effect on AAT release in AATD patients, both children, and adults, than in healthy individuals, suggesting a defense mechanism against AATD. Conclusions. Hypoxia induces a more aggressive phenotype in neutrophils from AATD patients with an increase in their ability to release protein granules, production, and release of proinflammatory cytokines and reactive species, aggravating tissue damage in AATD patients.	en_US
dc.format.extent	375 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	EPOC	es_ES
dc.subject	déficit de alfa-1 antitripsina	es_ES
dc.subject	neutrófilos	es_ES
dc.subject	estrés oxidativo	es_ES
dc.subject	hipoxia	es_ES
dc.title	Efecto de la hipoxia en la degranulación, producción de citoquinas y perfil oxidativo de neutrófilos en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS	es_ES
dc.embargo.terms	1 month	es_ES