La endocarditis infecciosa (EI) es una enfermedad de baja incidencia, diagnóstico complejo y elevada mortalidad que, a pesar de los avances tecnológicos, sigue constituyendo un reto tanto diagnóstico como terapéutico. Uno de los pilares del diagnóstico etiológico es el hemocultivo, sin embargo, este puede ser negativo hasta en un 30% de los casos. Los métodos de diagnóstico moleculares son una importante alternativa para la identificación del agente causal. En pacientes sometidos a cirugía, la técnica molecular más estudiada es la PCR universal seguida de secuenciación, en la que se secuencia el material genético de bacterias y hongos presente en el tejido valvular. El objetivo de este trabajo ha sido comprobar la validez de la PCR universal seguida de secuenciación, realizada directamente del tejido valvular, como parte de la rutina diagnóstica de la EI en un laboratorio de microbiología, y comparar los resultados con aquellos obtenidos por métodos clásicos. Se realizó la PCR universal seguida de secuenciación en 102 muestras de 69 pacientes con sospecha o diagnóstico de EI según los criterios de Duke modificados, y en 43 muestras pertenecientes a 42 pacientes de un grupo control sin sospecha de infección. Por medio de esta técnica, se consiguió identificar el agente causal en 42 de los 52 pacientes con EI definitiva; en 39 casos coincidió con el resultado del hemocultivo y en dos casos coincidió únicamente con el resultado del cultivo de tejido valvular. En el paciente restante, todos los cultivos fueron negativos, pero se observaron cocos grampositivos en la tinción de Gram del tejido valvular, y se detectó Streptococcus gallolyticus mediante la PCR universal. Por otro lado, esta técnica fue negativa en 12 de los 15 pacientes del grupo de estudio con EI descartada y en todos los casos del grupo control. Se obtuvo una sensibilidad de 80,8% (IC 95%: 67-89,9), una especificidad de 98,2% (IC 95%: 89-99,9), un valor predictivo positivo de 97,7% (IC 95%: 89-99,9) y un valor predictivo negativo de 84,4% (IC 95%: 72,7-91,9). La eficiencia diagnóstica de la técnica fue de un 89,7%. En cuanto al diagnóstico clásico, el hemocultivo fue la técnica microbiológica que presentó una mayor sensibilidad, 86,5% (IC 95%:73,6-94%), mientras que con el cultivo de válvula no se identificó el agente causal en el 71% de los casos. La tinción de Gram destacó por su elevado valor predictivo positivo, 100% (IC 95%: 74,7-100%). Se obtuvo un coeficiente kappa de 0,94 (concordancia de 97,2%), establecido como “concordancia casi perfecta” entre el diagnóstico clásico y molecular. Respecto al estudio anatomopatológico, en el 83,9% de los casos de EI definitiva se observaron en la muestra lesiones compatibles con el proceso infeccioso. Así pues, la PCR universal seguida de secuenciación permitió identificar el agente causal, confirmar el diagnóstico etiológico en caso de discordancia entre los resultados de los cultivos de sangre y tejido valvular, y afianzar el diagnóstico en los pacientes con EI descartada. En tejido valvular, esta técnica presentó una sensibilidad significativamente mayor que el cultivo valvular, por lo se debería considerar su inclusión en los criterios diagnósticos vigentes. La tinción de Gram permitió valorar los resultados moleculares, teniendo en cuenta la persistencia de material genético de los microorganismos en el tejido. La realización del estudio anatomopatológico en tejido valvular también permitió valorar los resultados del diagnóstico microbiológico cuando existieron discordancias. En una entidad tan compleja como la EI, es necesario utilizar todas las herramientas diagnósticas a nuestro alcance. Todas las áreas de diagnóstico de laboratorio son complementarias y no excluyentes y deberían ser valoradas conjuntamente.