Background: obesity in adults is defined as an abnormal or excessive fat accumulation that presents a significant risk factor for health and contributes to increased morbidity and mortality. Although underlying health conditions and genetics could be in some cases the principal causes of obesity, it is predominantly the result of long-term unhealthy lifestyles. In its clinically most severe form (or Class III obesity) adipose tissue becomes the largest metabolic endocrine organ that strongly interacts with the endocrine system and contributes to the development of metabolic syndrome (MetS). MetS is considered the most common metabolic health problem related to obesity nowadays and it involves signs (central obesity, low high-density lipoprotein cholesterol (HDL), hypertriglyceridemia, hypertension, hyperglycemia) that could be related to the presence of abnormal metabolism and metabolome alterations. The metabolome is directly influenced by the diet and is the output of genes-environment interaction, of which epigenetics regulations represent their linker. So, a possible interconnection between metabolomics and epigenetics is reasonable, with repercussions on the epigenetic age, the functional state of the whole organism and its lifespan. Although MetS affects both men and women indistinctly, the prevalence of each MetS risk factor is reported to be sex- and age-dependent and it is affected by hormonal and endocrine processes. In particular, MetS is a significant health problem in postmenopausal women. This could be related to sex hormone levels and adipose tissue's disposition, metabolism and endocrine action that cause cardiovascular complications and accelerated ageing of multiple organs and their malfunction, especially in the elderly. Aims: 1) to investigate the influence of sex and age on the metabolic profile of subject with clinically severe obesity and metabolically healthy status (MHO) and patients with MetS through the study of differences in their metabolome and epigenome under the hormonal and endocrine influence in conjunction to sex and age; 2) to investigate the metabolome-epigenome-MetS interaction, its effects and the potential role of adipose tissue metabolism in the pathology; 3) to analyse specifically the metabolic profile of women of fertile age and postmenopausal and their comparison with men of the same age groups, focusing on extreme MetS (MetS.5); 4) to investigate the interactions between metabolome and epigenome in subjects over 54 years with MHO or MetS.5 to obtain a pathophysiological characterization patients at greater risk; 5) to use a high-fat diet (HFD) rat experimental model as a source of adipocytes for the in vitro validation of the hypotheses derived from the studies on the human cohort and to investigate the effect of a HFD diet on the metabolome of adipose tissue and adipocytes in MetS in severe obesity; 6) to evaluate by in vitro experiments the potential role of metabolomic and epigenetic modification induced by metabolites most significantly changed in subjects with MetS. Design and methods: a case-control study was conducted with 1350 subjects of the Piancavallo cohort (women 65 %, men 35 %; age 19-85 with extreme obesity (body mass index (BMI) ≥ 40 kg/m2 or between 35.0 and 39.9 kg/m² with one or more obesity-related comorbid conditions) was extensively characterized for clinical and anthropometrical profiles. The subjects were then divided into a total of four big subgroups for age and sex (women < 46 years, women > 54 years, men < 46 years and men > 54 years) and classified into controls MHO and cases MetS. Cases were further classified into MetS subgroups (MetS.3, MetS.4 and MetS.5) according to the International Diabetes Federation (IDF) Criteria (2005). Serum global metabolomic profiles were measured using nuclear magnetic resonance (NMR). Ninety-six subjects (48 cases MetS.5, 48 controls MHO; aged between 55-85 years for both groups) were selected for the epigenetic analysis and global methylation levels were measured in serum using the Infinium MethylationEPIC BeadChip kit. Perigonadal fat pads were obtained from male and female Wistar rats fed with a modified HFD (45 % of fat) or fed with a control diet (4% fat) and sacrificed after 20 weeks of treatment. Cultures of adipocytes and adipose tissues were performed to collect metabolized culture media. Global metabolomic profiles of culture media were measured using NMR. Specific statistical analyses were developed. Results: according to the anthropometric and clinical characterization, the global metabolic profile of MetS resulted uniformly different from MHO in the entire cohort, with a visible, constant and progressive change of the metabolites' levels according to the worsening of MetS gravity. MetS.5 showed the most significant difference in the metabolic profile and altered metabolic pathways. Moreover, PLS-DA scores plots revealed specific metabolic changes in control and MetS.5 groups of men and women related to sex and age. The differential profiles differed in the variety and the number of significant metabolites, especially between fertile and postmenopausal ages. Acetone was the preeminent metabolite in MetS.5 women’s group of fertile age. Instead, postmenopausal women showed a raise in carbonyls in fatty acid 2 (FACO2) and low-density lipoprotein 2 (LDL2) cholesterol signals, which were the metabolites most significantly related to MetS.5. On the contrary, in men, leucine and choline-containing compounds (CCC) showed the main involvement in MetS.5 until 45 and after 55 years, respectively. Therefore, the metabolic pathways involved in MetS and MetS.5 were different between men and women of different ages, even though the disease had a common basis regardless of sex. At the epigenetic level, the global methylation levels were comparable between cases and controls. However, differential methylation analysis identified two statistically significant probes belonging to TXNIP (thioredoxin interacting protein) and MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein) genes related to hyperglycemia and hypercholesterolemia. The epigenetic drift revealed in MetS.5 the decrease in the average number of stochastic epigenetic mutations (SEMs), which appeared more pronounced in the cohort of males. The biological age, reflected by the predictor of lifespan (DNAm GrimAge), resulted significantly higher in MetS.5 cohort. The GrimAge also appeared to be higher, on average, in men than in women of similar chronological age, regardless of disease status, although the diagnosis of MetS was related to a worse epigenetic scenario. Finally, the metabolomic analysis of the adipocytes' growth medium extracted from the perigonadal fat pads of control and HFD rats also showed significant differences related to the diet and sex of the animals. Nevertheless, the causes and contributors were non-identical between our human cohort and the rat model under study. Methionine/isoleucine, jointly, constituted the metabolites primarily associated with HFD in adipocyte cell cultures and the most significant metabolites in female HFD rats. Differently, 3methyl2oxovalerate was the most significant metabolite in males. Glutamine showed the highest VIP score value in adipose tissue organ cultures probably because of the presence of macrophages that play a critical role in initiating, maintaining, and resolving inflammation caused by the hypertrophy of adipocytes. Conclusions: the study of clinically severe obesity both at the clinical, anthropometric and above all at the metabolomic-epigenetic level represents an aid to the discovery of risk biomarkers for the development of metabolically unhealthy obese status (MUHO) and MetS. Combined with the epigenetics data, the metabolomic results may provide new insights into the pathophysiological mechanisms in severe healthy or unhealthy obesity and MetS, with a particular focus on the reciprocal relationship between the epigenome and the metabolome under the influence of sex, age and endocrine function of adipose tissue. MUHO women and men have a different age-related risk factor that is highlighted and reflected between metabolic and epigenetic profiles, manifested by the difference between chronological and biological (epigenetic) age between men and women. The latter may have some protection provided by estrogens until menopause which allows them to remain "metabolically and physiologically younger" even when the influence of estrogens decreases. Studying these biomarkers involved in the development and characterization of the disease in different stages of life and sex could help to provide new targets for preventive and therapeutic strategies and therapies. Moreover, cell models could be used to provide further evidence in vitro on the results of the studies on human samples. Based on patients' specific biological and clinical characteristics, this evidence could provide new insight for pharmacological, behavioural and nutritional strategies on host/microbiota co-metabolism and metabolic pathways, and progress towards personalized medicine.Antecedentes: la obesidad en adultos se define como una acumulación anormal o excesiva de grasa que representa un importante factor de riesgo para la salud, contribuyendo a aumentar la morbilidad y la mortalidad. Aunque las condiciones de salud subyacentes y la genética podrían ser en algunos casos las principales causas de la obesidad, en la mayoría de los casos es el resultado de estilos de vida poco saludables a largo plazo. En su forma más severa clínicamente (obesidad de Clase III), el tejido adiposo se convierte en el órgano endocrino metabólico más grande que interactúa fuertemente con el sistema endocrino y contribuye al desarrollo del síndrome metabólico (MetS). El MetS es considerado el problema de salud metabólico más comunemente relacionado con la obesidad en la actualidad y presenta signos (obesidad central, colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL) bajo, hipertrigliceridemia, hipertensión, hiperglucemia) que podrían estar relacionados con la presencia de un metabolismo anormal y alteraciones del metaboloma. El metaboloma está directamente influenciado por la dieta y es el resultado de la interacción genes-ambiente, de la que las regulaciones epigenéticas representan su nexo de unión. Por tanto, es lógico pensar que exista una posible interconexión entre la metabolómica y la epigenética, que repercuta en la edad epigenética, el estado funcional de todo el organismo y su esperanza de vida. Aunque MetS afecte tanto a hombres como a mujeres indistintamente, la prevalencia de cada factor de riesgo de MetS aparece depender del sexo y la edad y se ve afectada por procesos hormonales y endocrinos. En particular, MetS es un problema de salud importante en mujeres posmenopáusicas. Esto podría estar relacionado con los niveles de hormonas sexuales y la disposición, metabolismo y acción endocrina del tejido adiposo que provocan complicaciones cardiovasculares y el envejecimiento acelerado de múltiples órganos y su mal funcionamiento, especialmente en los ancianos. Objetivos: 1) investigar la influencia del sexo y la edad en el perfil metabólico de sujetos con obesidad clínicamente severa y estado metabólicamente saludable (MHO) y pacientes con MetS a través del estudio de las diferencias en su metaboloma y epigenoma bajo la influencia hormonal y endocrina en relación con el sexo y años; 2) investigar la interacción metaboloma-epigenoma-MetS, sus efectos y el papel potencial del metabolismo del tejido adiposo en la patología; 3) analizar específicamente el perfil metabólico de las mujeres en edad fértil y posmenopáusicas y su comparación con los hombres de los mismos grupos de edad, centrándose en el MetS extremo (MetS.5); 4) investigar las interacciones entre metaboloma y epigenoma en sujetos mayores de 54 años con MHO o MetS.5 para obtener una caracterización fisiopatológica de los pacientes de mayor riesgo; 5) utilizar un modelo experimental de rata con dieta alta en grasas (HFD) como fuente de adipocitos para la validación in vitro de las hipótesis derivadas de los estudios en la cohorte humana y la investigación dirigida al efecto de la dieta en el metaboloma del tejido adiposo y adipocitos en MetS en obesidad severa; 6) evaluar mediante experimentos in vitro el papel potencial de la modificación metabolómica y epigenética inducida por los metabolitos más significativamente modificados en sujetos con MetS. Diseño y métodos: se realizó un estudio caso-control con 1350 sujetos de la cohorte de Piancavallo (mujeres 65 %, hombres 35 %; edad 19-85) con obesidad extrema (índice de masa corporal (IMC) ≥ 40 kg/m2 entre 35,0 y 39,9 kg/m² con una o más condiciones comórbidas relacionadas con la obesidad) fueron ampliamente caracterizados por perfiles clínicos y antropométricos. A continuación, los sujetos se dividieron en un total de cuatro grandes subgrupos por edad y sexo (mujeres < 46 años, mujeres > 54 años, hombres < 46 años y hombres > 54 años) y clasificados en controles MHO y casos MetS. Los casos se clasificaron además en subgrupos de MetS (MetS.3, MetS.4 y MetS.5) de acuerdo con los Criterios de la Federación Internacional de Diabetes (IDF) (2005). Los perfiles metabolómicos globales séricos se midieron mediante resonancia magnética nuclear (RMN). Se seleccionaron 96 sujetos (48 casos MetS.5, 48 controles MHO; con edades comprendidas entre 55 y 85 años para ambos grupos) para el análisis epigenético y los niveles de metilación global se midieron en suero utilizando el kit Infinium MethylationEPIC BeadChip. Los acúmulos de grasa perigonadal se obtuvieron de ratas Wistar machos y hembras alimentadas con una dieta modificada enriquecida en grasas HFD (45 % de grasa) o alimentadas con una dieta de control (4 % de grasa) y sacrificadas después de 20 semanas de tratamiento. Se realizaron cultivos de adipocitos y tejidos adiposos para recoger los medios de cultivo metabolizados. Los perfiles metabolómicos globales de los medios de cultivo se midieron mediante RMN. Se desarrollaron análisis estadísticos específicos. Resultados: en línea con la caracterización antropométrica y clínica, el perfil metabólico global de MetS resultó uniformemente diferente de MHO en toda la cohorte, con un cambio visible, constante y progresivo de los niveles de metabolitos de acuerdo con el empeoramiento de la gravedad de MetS. MetS.5 mostró la diferencia más significativa en el perfil metabólico y rutas metabólicas alteradas. Además, los diagramas de dispersión tipo PLS-DA a partir de los espectros de RMN revelaron cambios metabólicos específicos en grupos de control y MetS.5 de hombres y mujeres relacionados con el sexo y la edad. Los perfiles diferenciales diferían en la variedad y el número de metabolitos significativos, especialmente entre la edad fértil y la posmenopáusica. La acetona fue el metabolito preeminente en el grupo de mujeres MetS.5 en edad fértil. En cambio, las mujeres posmenopáusicas mostraron un aumento en las señales de carbonilos en ácidos grasos 2 (FACO2) y de colesterol de lipoproteínas de baja densidad 2 (LDL2), que fueron los metabolitos más significativamente relacionados con MetS.5. Por el contrario, en los hombres, la leucina y los compuestos que contienen colina (CCC) mostraron una mayor repercusión en el MetS.5 hasta los 45 y después de los 55 años, respectivamente. Por lo tanto, aunque la enfermedad tenga una base común independientemente del sexo, las vías metabólicas involucradas en MetS y MetS.5 fueron diferentes entre hombres y mujeres de diferentes edades. El análisis epigenético mostró niveles globales de metilación fueron comparables entre casos y controles. Sin embargo, el análisis de metilación diferencial identificó dos sondas estadísticamente significativas pertenecientes a los genes TXNIP (proteína que interactúa con tiorredoxina) y MYLIP (proteína que interactúa con la cadena ligera reguladora de miosina) relacionados con la hiperglucemia y la hipercolesterolemia. La deriva epigenética reveló en MetS.5 la disminución, en el número promedio de mutaciones epigenéticas estocásticas (SEMs), que apareció más pronunciada en la cohorte de hombres. La edad biológica, reflejada por el predictor de esperanza de vida (DNAm GrimAge), resultó significativamente mayor en la cohorte MetS.5. El GrimAge también pareció ser mayor, en promedio, en hombres que mujeres de edad cronológica similar, independientemente del estado patológico, aunque el diagnóstico de MetS se relacionó con un peor escenario epigenético. Finalmente, el análisis metabolómico del medio de crecimiento de adipocitos extraídos de los acúmulos de grasa perigonadal de ratas control y HFD también mostró diferencias significativas relacionadas con la dieta y el sexo de los animales. Sin embargo, las causas y los factores que contribuyen al síndrome metabólico no fueron idénticos entre nuestra cohorte humana y el modelo de estudio en rata. La metionina/isoleucina, combinadas, constituyeron los metabolitos principalmente asociados con HFD en cultivos celulares de adipocitos y los metabolitos más significativos en ratas HFD hembras. Por el contrario, el 3metil2oxovalerato fue el metabolito más significativo en los machos. La glutamina mostró el VIP score más alto en cultivos de tejido adiposo, probablemente por la presencia de macrófagos que juegan un papel fundamental en el inicio, mantenimiento y resolución de la inflamación causada por la hipertrofia de los adipocitos. Conclusiones: el estudio de la obesidad clínicamente severa tanto a nivel clínico y antropométrico como sobre todo a nivel metabolómico-epigenético representa una ayuda para el descubrimiento de biomarcadores de riesgo para el desarrollo del estado de obesidad metabólicamente no saludable (MUHO) y el MetS. Combinados con los datos epigenéticos, los resultados metabolómicos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos fisiopatológicos en la obesidad grave saludable o no saludable y MetS, con un enfoque particular en la relación recíproca entre el epigenoma y el metaboloma bajo la influencia del sexo, la edad y la función endocrina del tejido adiposo. Las mujeres y los hombres de MUHO tienen diferentes factores de riesgo relacionados con la edad que se destacan y reflejan entre los perfiles metabólicos y epigenéticos, puestos de manifiesto por la diferencia entre la edad cronológica y la edad biológica (epigenética) entre hombres y mujeres. Estas últimas pueden tener cierta protección proporcionada por los estrógenos hasta la menopausia, lo que les permite permanecer "metabólica y fisiológicamente más jóvenes" incluso cuando la influencia de los estrógenos disminuye. El estudio de estos biomarcadores implicados en el desarrollo y caracterización de la enfermedad en diferentes etapas de la vida y el sexo podría ayudar a proporcionar nuevas dianas para estrategias y terapias preventivas y terapéuticas. Además, los modelos celulares podrían utilizarse para proporcionar más pruebas in vitro sobre los resultados de los estudios en muestras humanas. En función de las características biológicas y clínicas específicas de los pacientes, esta evidencia podría proporcionar nuevos conocimientos para las estrategias farmacológicas, conductuales y nutricionales sobre el cometabolismo huésped/microbiota y las vías metabólicas, y el progreso hacia la medicina personalizada.