NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Characterization of the metabolic profile and identification of potential therapeutic targets in advanced prostate cancer patients

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Characterization of the metabolic profile and identification of potential therapeutic targets in advanced prostate cancer patients

dc.contributor.advisor	Puchades Carrasco, Leonor
dc.contributor.advisor	Pineda Lucena, Antonio
dc.contributor.advisor	López Guerrero, José Antonio
dc.contributor.author	Gómez Cebrián, Nuria
dc.contributor.other	Departament de Bioquímica i Biologia Molecular	es_ES
dc.date.accessioned	2023-05-09T09:13:15Z
dc.date.available	2023-05-10T04:45:05Z
dc.date.issued	2023	es_ES
dc.date.submitted	19-05-2023	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10550/86401
dc.description.abstract	INTRODUCCIÓN El cáncer de próstata (CaP) representa el segundo tumor en incidencia en hombres y es la quinta causa de muerte por cáncer a nivel global. El CaP es un tumor hormono-dependiente, que requiere de la activación del receptor de andrógenos (AR) para su proliferación. Clínicamente, se caracteriza por una gran variabilidad en su evolución, progresando desde una condición indolente hasta un fenotipo agresivo que puede diseminarse y metastatizar a los nodos linfáticos y huesos. Actualmente, el diagnóstico temprano del CaP se realiza mediante la determinación sérica del antígeno prostático específico (PSA) y el examen rectal digital (DRE). Si estas pruebas dan resultados anómalos y hay sospecha de CaP, se realiza una biopsia guida por ultrasonido transrectal (TRUS) para la confirmación histológica. Sin embargo, estas pruebas presentan una baja sensibilidad y especificidad, y conllevan un alto riesgo de sobre-diagnóstico y sobre-tratamiento de los pacientes, especialmente en los casos de CaP indolente. Una vez se ha confirmado el diagnóstico, se utiliza el sistema de gradación de la escala de Gleason (GS) para evaluar la agresividad del tumor, en base a sus características histológicas, y estratificar a los pacientes según su pronóstico. Aunque el sistema de Gleason ha sido modificado varias veces, todavía presenta ciertas limitaciones que dificultan distinguir con precisión entre tumores indolentes y agresivos de CaP. El tratamiento del CaP depende del estadio tumoral y del pronóstico de cada paciente. Así, los tumores en etapas tempranas se tratan, inicialmente, mediante radioterapia o prostatectomía radical. Debido a la dependencia del CaP a los andrógenos para proliferar, estos tratamientos suelen combinarse con la terapia de deprivación androgénica (TDA) con el objetivo de reducir los niveles de testosterona circulante. Sin embargo, la respuesta a este tratamiento es transitoria debido a que, tras 18-36 meses, la mayoría de los pacientes desarrollarán resistencia a la TDA y progresarán a un CaP resistente a la castración (CPRC). Para estos pacientes, los tratamientos disponibles se basan en quimioterapia, hormonoterapia, inmunoterapia o inhibidores de PARP. A pesar de los avances realizados para comprender mejor los procesos moleculares y biológicos involucrados en la progresión del CaP, actualmente no existen biomarcadores específicos ni estrategias terapéuticas eficientes para la detección y tratamiento de este tumor en estadios avanzados. La metabolómica representa una herramienta muy prometedora y particularmente apropiada para la identificación de biomarcadores no invasivos con utilidad clínica en el diagnóstico y el seguimiento de pacientes. Esto se debe a que el metaboloma está muy ligado al fenotipo de la enfermedad, proporcionando información sobre alteraciones debidas a cambios en la expresión génica, estilo de vida, patologías y/o respuesta a tratamientos. Esta aproximación se puede integrar con otros datos, obtenidos mediante técnicas ómicas complementarias y otros estudios clínicos, consiguiendo así obtener un visión global y más precisa de la enfermedad, así como una descripción más detallada del estado del paciente y de la evolución de la enfermedad. Por otro lado, la medicina de precisión constituye una de las vías con mayor potencial en la mejora de la atención médica y el tratamiento de los pacientes con cáncer. Mediante la regulación específica de la actividad de algunas dianas terapéuticas claves, se podría llegar a controlar el crecimiento tumoral y la formación de metástasis. Aunque el concepto de medicina de precisión no es nuevo, la aparición de las ciencias ómicas junto con los notables avances tecnológicos en las plataformas de análisis, han sentado las bases de esta aproximación. Las terapias dirigidas se basan en el estudio del estatus genético específico de las células tumorales. Una aplicación muy útil de este tipo de estudios es la identificación de vulnerabilidades genéticas específicas que puedan ayudar a descubrir nuevas dianas terapéuticas. En este contexto, mediante cribados de silenciamiento de genes, se pueden analizar los efectos inducidos a partir del bloqueo parcial de la actividad de un gen por ARN de interferencia (knock-down), o del bloqueo total del gen (knock-out) utilizando técnicas de edición génica (CRISPR). Estos cribados pueden ayudar a identificar perfiles moleculares específicos, requeridos por las células tumorales para su proliferación. Además, la comparación en estos cribados entre tejidos sanos y tumorales puede contribuir a identificar genes esenciales únicamente en el tumor, siendo éstos considerados potenciales dianas terapéuticas para el desarrollo de terapias anticancerosas específicas. OBJETIVOS Como se ha descrito en la introducción, el CaP se define como un cáncer biológicamente heterogéneo y con un curso clínico muy variable. El manejo óptimo del CaP presenta muchos retos debido a la dificultad en predecir qué pacientes con tumores en estadios tempranos desarrollarán una progresión metastática del tumor. Además, no existe un sistema de clasificación que permita discriminar con precisión entre tumores de CaP indolentes y agresivos. Por tanto, la identificación de nuevos biomarcadores asociados a la progresión de la enfermedad podría contribuir a mejorar el panorama actual de estos pacientes. Por otro lado, el CaP continúa siendo incurable cuando progresa a etapas más avanzadas, por lo que nuevas opciones terapéuticas, basadas en la medicina personalizada, podrían contribuir a aumentar la supervivencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes con CaP. En este contexto, la aplicación de distintas tecnologías ómicas representa una estrategia prometedora para el desarrollo de nuevos biomarcadores no invasivos, y para la identificación de vulnerabilidades genéticas, esenciales para la proliferación tumoral, que podrían ser evaluadas en profundidad como posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de nuevos fármacos. Por tanto, teniendo en cuenta estos antecedentes, el presente trabajo de investigación tiene como finalidad abordar los siguientes objetivos y sub-objetivos: 1. Caracterizar cambios metabólicos asociados a la progresión del CaP. i. Caracterizar el perfil metabólico de orina y suero de pacientes con CaP avanzado. ii. Identificar alteraciones metabólicas específicas en los pacientes con CaP avanzado. 2. Caracterizar vulnerabilidades genéticas específicas del CaP avanzado. i. Identificar nuevas y potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento del CaP avanzado. ii. Validar funcionalmente las potenciales dianas terapéuticas. METODOLOGÍA Y RESULTADOS 1. Caracterización de cambios metabólicos asociados a la progresión del CaP Para el estudio de la caracterización del perfil metabólico del CaP agresivo se analizaron 78 muestras de suero y 84 muestras de orina de pacientes con CaP, recogidas por el departamento de urología y el biobanco del Instituto Valenciano de Oncología y congeladas a -80ºC. Se utilizó el valor del GS para clasificar a los pacientes en dos grupos (GS bajo y GS alto), definiendo un valor de GS de 7 como punto de corte. Las muestras se procesaron siguiendo protocolos descritos para estudios de metabolómica por resonancia magnética nuclear (RMN) y se analizaron en un espectrómetro de 500 MHz. La adquisición de los espectros de las muestras de suero se realizó a 310 K, utilizando la secuencia de pulso 1D-CPMG, mientras que para la adquisición de los espectros de las muestras de orina se utilizó una temperatura de 300 K y la secuencia de pulso 1D-NOESY. Los espectros obtenidos fueron transformados, faseados y se corrigió la línea base de manera automática. Tras la adquisición, y teniendo en cuenta las características de cada biofluido, los espectros fueron procesados siguiendo distintos protocolos. Primero, se definió la región del espectro a integrar, y se excluyeron las señales del agua y la urea en ambos biofluidos. A continuación, los espectros de suero se referenciaron con la señal del TSP (0.00 ppm), se dividieron en regiones de tamaño constante (0.01 ppm), y se normalizaron respecto al área total de cada espectro. Por otro lado, los espectros de orina se dividieron en regiones constantes de 0.001 ppm, se alinearon utilizando el paquete de R ‘speaq’, y se normalizaron respecto al área total de cada espectro y mediante la normalización con cociente probabilístico. Una vez procesados, se utilizaron diferentes bases de datos para asignar los metabolitos presentes en los espectros de cada biofluido. Finalmente, para cada metabolito identificado, las regiones de integración para las señales correspondientes fueron definidas. Se utilizó el programa Mnova para integrar y cuantificar las regiones seleccionadas. Con el objetivo de evaluar la homogeneidad de las muestras incluidas en cada grupo de estudio e identificar muestras presentando un comportamiento anómalo (potenciales outliers), se realizó un análisis exploratorio mediante la combinación de métodos no supervisados de reconocimiento por patrones (análisis de componentes principales - PCA), utilizando el programa SIMCA-P, y la inspección visual de los espectros. En los espectros de suero, este análisis reveló un conjunto de muestras que presentaban señales intensas correspondientes a etanol, una muestra con picos correspondientes a una contaminación por EDTA y un subgrupo de pacientes que presentaban niveles inusualmente elevados de glucosa. Los picos correspondientes a EDTA pueden deberse al tipo de tubos que se utilizó para recoger la muestra. Para evitar que estas señales pudieran interferir con otras señales del espectro y debido a que este compuesto se utiliza para la recogida de muestras de plasma, esta muestra fue eliminada del análisis. En cuanto a los pacientes que presentaban señales de etanol y niveles anormalmente altos de glucosa, se examinaron los espectros de estos mismos pacientes en las muestras de orina y se observó que se reproducía el mismo perfil metabólico que en las muestras de suero. La presencia de las señales de etanol no se pudo asociar con ninguna de las variables recogidas en la historia clínica, por lo que podría deberse a la ingesta. Debido a que uno de los criterios de recogida de las muestras era que debía hacerse en ayunas, estos pacientes fueron excluidos del análisis en ambos biofluidos. En cuanto a los pacientes que presentaban niveles anormalmente altos de glucosa, se examinó su historia clínica y se observó que todos ellos eran diabéticos. Para evitar que estas señales tan intensas pudieran interferir con otras señales del espectro, y debido a que uno de los criterios de inclusión era que los pacientes de CaP no debían presentar ninguna otra enfermedad, todos los pacientes diabéticos fueron excluidos del análisis tanto de suero como de orina. Tras la exclusión justificada de los outliers, los análisis estadísticos multivariantes finalmente incluyeron 66 muestras de suero y 73 muestras de orina. En primer lugar, se utilizó el PCA, un método no supervisado, para evaluar el potencial impacto de las diferentes variables clínicas (edad, PSA, IMC, enfermedad metastática y GS) sobre la distribución de las muestras de suero y orina. En ninguno de los modelos construidos, se observó un impacto significativo de las variables clínicas estudiadas sobre la distribución de las muestras en el espacio. A continuación, se definió la clase (GS bajo vs GS alto) a la que pertenecía cada individuo, y se empleó el método supervisado de análisis discriminante de mínimos cuadrados con corrección ortogonal (OPLS-DA) como método de discriminación. El modelo construido para cada biofluido reveló una capacidad reducida para la discriminación entre los grupos de estudio. A continuación, se evaluó la validez de ambos modelos mediante el test de permutación (n = 100). Para las muestras de suero, se observó que no había diferencias al comparar los valores estadísticos permutados con respecto a los valores obtenidos en el modelo real. Por otro lado, en la validación interna del modelo de orina, el valor estadístico R2Y superaba los valores aconsejables, indicando que el modelo obtenido estaba sobreajustado, además de presentar una capacidad de predicción baja. Con el fin de poder identificar diferencias metabólicas específicas entre los pacientes con GS bajo y alto, se realizó un análisis dirigido de los datos de RMN utilizando la información transcriptómica disponible en muestras de tejidos tumorales de CaP. Para ello, se llevó a cabo una búsqueda en el repositorio de GEO y se seleccionaron los estudios transcriptómicos que cumplían con los siguientes criterios de selección: analizar muestras de CaP en tejido humano, analizar el perfil de expresión génica utilizando microarrays, incluir información disponible de la variable clínica de GS, y tamaño muestral mayor de 30 muestras. En los tres estudios en esta revisión (gse16560, gse46602 y gse70768) se normalizaron los datos a escala logarítmica en base 2 (log2) cuando fue necesario y, en el caso de existir varias sondas para el mismo gen, se calculó la media de todas las sondas para obtener el valor más representativo. Adicionalmente, se evaluó la homogeneidad de las muestras mediante análisis no supervisado. A continuación, para cada gene, se calculó el fold-change (FC) entre los grupos de GS bajo y alto, y se utilizando el test no paramétrico de Mann-Whitney U para realizar un análisis de expresión diferencial entre ambos grupos. El FC y el p-valor obtenido del análisis de expresión diferencial se utilizaron para identificar rutas metabólicas alteradas entre los grupos de estudios mediante un análisis de enriquecimiento de genes centrado en genes relacionados con metabolismo. Para ello, se utilizaron las funciones incluidas en el paquete de R “mdgsa”, y se seleccionaron las rutas metabólicas que presentaban diferencias estadísticamente significativas (p-valor < 0.05). En total, se identificaron 36 rutas significativamente alteradas entre los grupos de GS bajo y alto. A continuación, se identificaron los metabolitos involucrados en cada ruta y se asignaron las señales correspondientes en los espectros de RMN. En total, se identificaron 23 y 22 metabolitos en los espectros de suero y orina, respectivamente. Tras la cuantificación de las señales, se llevó a cabo un análisis univariante utilizando el test de Mann-Whitney U para comparar las intensidades de cada metabolito entre los pacientes con GS bajo y alto. Este análisis reveló que, en comparación con los pacientes con GS bajo, el suero de los pacientes con GS alto presentaba concentraciones significativamente elevadas de glucosa y glicina, mientras que la orina de estos mismos pacientes exhibía niveles significativamente más altos de 1-metilnicotinamida. Además, en ambos biofluidos se observaron niveles más elevados de fenilalanina en los pacientes con GS alto, aunque en ningún caso las diferencias fueron estadísticamente significativas. 2. Caracterización de vulnerabilidades genéticas específicas en CaP avanzado Para la caracterización de vulnerabilidades genéticas en CaP avanzado, se utilizaron los datos de cribados genéticos en 501 líneas celulares disponibles en la base de datos DepMap. En primer lugar, se seleccionaron los datos de las siete líneas celulares de CaP disponibles en la base de datos. A continuación, para cada gen analizado en cada una de las líneas celulares, se calculó el valor de esencialidad siguiendo una aproximación muy similar a la descrita por Hart et al. Brevemente, esta estrategia se basa en la utilización de una lista de referencia de genes clasificados como esenciales y no esenciales para la proliferación celular, a partir de la cuál, para cada gen, se calcula un clasificador bayesiano (factor bayesiano (FB)) que define la probabilidad de que un determinado gen pertenezca a la lista de genes esenciales (FB > 0) o no esenciales (FB < 0). Una vez clasificados, se normalizaron los valores de FB a Z-scores para ordenar los genes dentro de cada línea celular,. Finalmente, se combinaron en una única lista todos los genes con un Z-score > 1.96 en alguna de las líneas celulares de CaP, y se seleccionaron aquellos genes clasificados como esenciales en al menos el 50% de las líneas de CaP analizadas. Siguiendo esta estrategia, se detectaron un total de 199 vulnerabilidades genéticas asociadas al CaP. Para evaluar la relevancia terapéutica de estas vulnerabilidades genéticas, se analizó la expresión de los 199 genes en muestras de tejido de individuos sanos y de pacientes diagnosticados con diferentes estadios de CaP. Para ello, se realizó una revisión de los datos disponibles en el repositorio GEO y se seleccionaron los estudios transcriptómicos de CaP que cumplían con los criterios de selección definidos: analizar muestras de tejido humano, analizar el perfil de expresión génica utilizando microarrays, incluir un tamaño muestral mayor de 50 muestras, y analizar muestras de al menos dos de los grupos de estudio (tejido sano, CaP primario, CaP metastático). Otros criterios que también se tuvieron en cuenta para la selección de los estudios fueron la disponibilidad de datos relativos a la recurrencia de la enfermedad y la supervivencia del paciente. En base a estos criterios, se seleccionaron cinco estudios centrados en CaP (gse6919, gse35988, gse21035, gse10645 y gse46602). A continuación, los datos se normalizaron a escala logarítmica en base 2 (log2) cuando fue necesario y se evaluó la homogeneidad de las muestras en los distintos estudios. En el caso de existir varias sondas para el mismo gen, se calculó la media de todas las sondas para obtener el valor más representativo. En base a los datos disponibles en cada estudio, se llevó a cabo el análisis de expresión diferencial para los 199 genes seleccionados entre: i) tejido sano vs CaP, ii) tumores indolentes vs agresivos, o iii) CaP primario vs metastático. En la segunda comparación se utilizó la variable clínica de recurrencia bioquímica (RB) para clasificar a los pacientes en el grupo de tumores indolentes (no RB) o tumores agresivos (RB). Para cada comparación, la significancia estadística de la expresión diferencial de cada gen entre los grupos de estudio se evaluó utilizando el test de Mann-Whitney U. Se utilizó el método de Benjamin-Hochberg para ajustar el p-valor, y se seleccionaron los genes con un p-valor ajustado < 0.05 como estadísticamente significativos. Para la identificación de genes sobre-expresados en CaP con respecto a individuos sanos, se utilizaron dos de los estudios (gse6919 y gse35988). Tras el análisis de expresión diferencial entre los dos grupos, se determinó que 61 de los 199 genes definidos como esenciales en CaP estaban sobre-expresados de manera significativa en CaP en al menos uno de los estudios. La expresión de estos genes se evaluó entre tumores indolentes vs agresivos y entre CaP primario vs metastático. En la primera comparación, se utilizaron dos estudios (gse10645 y gse46602), y se identificaron 29 genes cuyos niveles de expresión eran significativamente más elevados en tumores agresivos en al menos uno de los estudios incluidos. Para la comparación de CaP primario vs metastático, se utilizaron tres estudios (gse6919, gse35988 y gse21035), y 17 genes fueron identificados como significativamente sobre-expresados en dos de los tres estudios analizados. En total, se seleccionaron 27 genes cuyos niveles de expresión eran significativamente más elevados en tumores agresivos o metastáticos en al menos el 50% de los estudios evaluados, 5 de ellos estaban sobre-expresados en ambas condiciones. A continuación, se evaluó la potencial correlación entre los niveles de expresión de cada uno de estos genes y la progresión del CaP en los pacientes. Para ello, se llevaron a cabo análisis de supervivencia utilizando el paquete de R “surviminer”, que permite representar la estimación de la función de supervivencia (método de Kaplan-Meier). Se seleccionaron los cuartiles inferior y superior como puntos de corte, y los pacientes se clasificaron, según los niveles de expresión del gen a analizar, en el grupo de baja o alta expresión. La significancia estadística del análisis se determinó mediante la prueba de Matel-Cox (log-rank test). y se seleccionaron los genes con un p-valor < 0.05 como estadísticamente significativos. Este análisis reveló que, para 16 de los genes evaluados, una mayor expresión estaba significativamente asociada a un peor pronóstico en los pacientes de CaP. Con el objetivo de evaluar potenciales interacciones entre los 16 genes seleccionados, así como su posible implicación funcional en el CaP, se utilizó la base de datos Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING) para construir una red de interacción proteína-proteína. En este análisis se observó que existían interacciones entre 11 de las proteínas seleccionadas, y que algunos de los grupos estaban significativamente asociados a funciones biológicas concretas. El análisis funcional de la red reveló que tres procesos biológicos estaban sobre-representados: la formación del complejo de iniciación de la transducción citoplasmática, la iniciación de la traducción citoplasmática, y el ensamblaje de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs) del espliceosoma. De estas 11 proteínas, tres de ellas estaban directamente asociadas con los procesos de traducción (EIF2S3, EIF3B y EIF3H), y otras tres con el ensamblaje del espliceosoma (LSM4, PRPF3 y SNRPE). En base a estos resultados, estas seis proteínas fueron seleccionadas para continuar con su evaluación como posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de nuevos fármacos en CaP. En primer lugar, se evaluó la posibilidad de poder modular la actividad de estas proteínas utilizando pequeñas moléculas (druggability) utilizando la información disponible en las bases de datos Uniprot, Protein Data Bank, CanSAR y Pharos. Para cada potencial diana terapéutica, se extrajo información relacionada con sus características biológicas, farmacológicas y estructurales. En particular, se determinó la disponibilidad de datos de estructura tridimensional, la presencia de potenciales sitios de unión en la estructura de la proteína, la existencia de inhibidores o ligandos conocidos, la localización subcelular, y la información disponible sobre su implicación en la progresión del CaP u otros cánceres. De acuerdo a la información recogida para cada una de las dianas implicadas en los procesos de traducción, se decidió evaluar el potencial de EIF3H como diana terapéutica para estadios avanzados del CaP. Por otro lado, LSM4 y SNRPE, relacionadas con el ensamblaje del espliceosoma, fueron seleccionados como candidatos preferentes para evaluar su posible papel como dianas terapéuticas en CaP en futuros análisis. La subunidad H del factor 3 de iniciación de la traducción (EIF3H) es una de las 13 subunidades que forman el complejo EIF3, el cual está implicado en varios pasos del proceso de iniciación de la traducción. Esta subunidad se localiza en el citoplasma, tiene un peso molecular de 39.930 dalton y está constituida por una secuencia de 352 aminoácidos. Existe información disponible sobre 11 estructuras 3D de la proteína, determinadas por microscopía electrónica. Aunque no hay ningún inhibidor o ligando descrito contra EIF3H, la base de datos canSAR predice un potencial sitio de unión en su estructura en base al análisis de diferentes características. Esta subunidad contiene un dominio MPN que se encuentra en las proteínas metaloproteasas y que ha sido relacionado con funciones de ubiquitinación y deubiquitinación. De hecho, varios artículos han descrito que EIF3H tiene actividad deubiquitinasa favoreciendo a la estabilidad de proteínas implicadas en la promoción de la agresividad tumoral (ej. SNAIL, YAP). Además, la base de datos UbiBrowser 2.0 incluye una predicción de 7 proteínas como posibles sustratos de EIF3H. En relación a los resultados obtenidos de los análisis de expresión diferencial en los datos de pacientes diagnosticados con CaP, se observó que EIF3H estaba sobre-expresado de manera significativa en CaP con respecto a tejidos sanos, así como en tumores agresivos y metastáticos en comparación con pacientes con tumores indolentes o primarios, respectivamente. Además, los análisis de supervivencia revelaron que una mayor expresión de EIF3H se correlacionaba significativamente con un tiempo de RB más corto y con peor supervivencia global. Con el objetivo de investigar en profundidad la implicación de EIF3H en la progresión del CaP, se utilizaron cuatro modelos celulares de próstata: uno representando la condición sana (RWPE-1), y tres líneas de CaP (22rv1, LnCaP y PC3) que difieren en su dependencia a andrógenos y su potencial metastático. En primer lugar, se extrajo RNA y proteínas de las cuatro líneas celulares, y se analizaron los niveles de expresión a nivel de RNA mensajero (mRNA), utilizando la técnica de RT-qPCR (Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), y a nivel de proteína mediante el análisis por western blot. Los resultados obtenidos mostraron que las líneas de CaP presentaban niveles significativamente más elevados de mRNA y de proteína en comparación con la línea sana. A continuación, se generó un modelo estable de inhibición (knock-down) y de sobre-expresión de EIF3H en el modelo celular de PC3. Para la generación del modelo knock-down, se utilizó el plásmido pLV, con resistencia a puromicina, conteniendo dos RNA de interferencia dirigidos al silenciamiento de EIF3H (sh-2 y sh-4) y un RNA control (sh-C), mientras que para el modelo de sobre-expresión se utilizó el plásmido pLV, incluyendo la secuencia para la sobre-expresión para EIF3H (Myc-EIF3H). Ambos plásmidos contenían además la secuencia para expresar la proteína de fluorescencia verde (GFP) y poder así detectar la eficiencia de la transfección. Tras clonar y purificar los vectores correspondientes, se transfectaron las células HEK 293T junto con los vectores necesarios para generar lentivirus (Gag/Pol, Rev y VSV-G). La eficiencia de la transfección se evaluó por la detección de la expresión de GFP. Tras 48 horas, las partículas virales generadas se utilizaron para infectar las células PC3. A las 24 horas de la infección, se comprobó la expresión de GFP y se utilizó una dosis de 1 g/mL de puromicina para seleccionar las células infectadas. Para evaluar la eficiencia del silenciamiento y de la sobre-expresión del gen, se llevaron a cabo experimentos de RT-qPCR y western blot. Los resultados revelaron que el vector sh-4, en comparación con el vector sh-C, reducía en un 90% los niveles de mRNA y de proteína, respectivamente. En cuanto al vector de sobre-expresión, se observó que, con respecto al vector pLV, los niveles de mRNA eran 2.2 veces más elevados mientras que los niveles de proteína de EIF3H aumentaban en un 50%. A continuación, se evaluó el efecto del silenciamiento y de la sobre-expresión de EIF3H en la proliferación, la eficiencia clonogénica, y la capacidad de migración de las células de CaP. Los resultados de estos experimentos demostraron que el silenciamiento de EIF3H reducía, de manera significativa, la proliferación, la capacidad clonogénica y la migración de las células PC3, mientras que la sobre-expresión de EIF3H favorece a la capacidad proliferativa, la capacidad clonogénica y de migración de las mismas células. Debido a las células deben realizar la transición epitelio-mesenquimal (EMT) para poder aumentar su capacidad de migración e invasión, se examinaron los cambios en niveles de proteína de algunos de los marcadores de la EMT tras el silenciamiento y sobre-expresión de EIF3H. Este análisis reveló que, mientras los niveles de E-cadherina aumentaban y que los de vimentina disminuían tras la inhibición de EIF3H, en el modelo de sobre-expresión se obtuvieron resultados opuestos, sugiriendo una posible implicación de EIF3H en la regulación de la EMT en las células de PC3. Finalmente, en base a la actividad deubiquitinasa de EIF3H, se llevó a cabo un ensayo de co-inmunoprecipitación con el objetivo de identificar distintas proteínas cuya estabilidad pudiera estar siendo regulada por los cambios en la expresión de EIF3H y estar además implicadas en la progresión del CaP. Con este fin, se realizó una inmunoprecipitación de EIF3H en los extractos proteicos obtenidos a partir de células PC3 infectadas con los vectores pLV y Myc-EIF3H, respectivamente. Posteriormente, se analizaron mediante espectrometría de masas todas las proteínas contenidas en la fracción eluida junto con EIF3H. Entre las proteínas que aparecían en las tres réplicas que sobre-expresaban EIF3H y no lo hacían en las réplicas infectadas con el vector pLV, destacó Staufen 1 (STAU1) debido a su potencial implicación en el proceso de tumorogénesis. STAU1 es una proteína de unión al ARN, implicada en varios procesos relevantes del metabolismo del ARN, cuya desregulación puede contribuir a la fisiopatología de varias enfermedades, entre ellas el cáncer. De hecho, distintos estudios han destacado su implicación en la promoción tumoral, y recientemente, se ha observado una posible implicación de STAU1 en la regulación del crecimiento, migración e invasión de modelos celulares de CaP. Además, distintos estudos han mostrado como STAU1 puede ser ubiquitinada y degradada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS). Dado que EIF3H ha sido descrita como una enzima deubiquitinasa, un posible efecto de la interacción directa observada podría ser la deubiquitinación de STAU1 por EIF3H, lo que podría contribuir a su estabilización, promoviendo así la progresión tumoral Futuros experimentos irán dirigidos a confirmar esta hipótesis y comprobar si el efecto de EIF3H sobre la progresión del CaP está mediada por la estabilización de STAU1. En ese caso, STAU1 podría representar una buena diana terapéutica para el futuro desarrollo de fármacos. STAU1 es una proteína que se encuentra en el citoplasma, tiene un peso molecular de 63.182 dalton y una secuencia formada por 577 aminoácidos. Existen datos sobre 4 estructuras 3D disponibles con resoluciones por debajo de los 3.0 Å. En relación a los datos de expresión en pacientes con CaP, se observó que STAU1 se encuentra sobre-expresada de manera significativa en CaP con respecto a individuos sanos, así como en tumores agresivos y metastáticos en comparación a pacientes con tumores indolentes o primarios, respectivamente. Además, los análisis de supervivencia revelaron que existe una correlación significativa entre una mayor expresión de STAU1 y un valor de GS más elevado, así como con un tiempo de RB más corto.	es_ES
dc.format.extent	258 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	metabolómica	es_ES
dc.subject	cáncer de próstata	es_ES
dc.subject	resonancia magnética nuclear	es_ES
dc.subject	dianas terapéuticas	es_ES
dc.subject	esencialidad génica	es_ES
dc.subject	biomarcadores	es_ES
dc.subject	metabolomics	es_ES
dc.subject	prostate cancer	es_ES
dc.subject	nuclear magnetic resonance	es_ES
dc.subject	therapeutic target	es_ES
dc.subject	gene essentiality	es_ES
dc.subject	biomarkers	es_ES
dc.title	Characterization of the metabolic profile and identification of potential therapeutic targets in advanced prostate cancer patients	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS TECNOLÓGICAS	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES
dc.rights.accessRights	open access	es_ES