NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del primer corpúsculo polar

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Diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del primer corpúsculo polar

dc.contributor.advisor	Escribá Pérez, María José
dc.contributor.advisor	Serra Serra, Vicente
dc.contributor.advisor	Bellver Pradas, José
dc.contributor.author	Soler Balaguer, Nuria
dc.contributor.other	Departament de Pediatria, Obstetrícia i Ginecologia	es_ES
dc.date.accessioned	2023-06-21T11:00:08Z
dc.date.available	2023-06-22T04:45:06Z
dc.date.issued	2023	es_ES
dc.date.submitted	09-06-2023	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10550/88404
dc.description.abstract	The development of new genetic screening technologies informs that the majority of the population is heterozygous carrier of some pathogenic variant causing monogenic diseases; generating half of their gametes free of the mutation and the other half carriers. In the field of assisted human reproduction, molecular diagnosis of oocytes would allow the selection of those free of a particular pathogenic variant prior to fertilization, maximizing the chances of obtaining healthy offspring or carriers, depending on the particular scenario of each couple. Currently, direct molecular study of the fertilizable oocyte is not possible, as its diagnosis implies its compromised viability. Alternatively, diagnostic inference is possible by studying the first polar body (PB1): a small structure, surrounded by membrane and with little cytoplasm, located in the perivitelline space of the mature MII oocyte; it is the result of the first reductional division of meiosis, presenting an allelic haplotype complementary to the information contained in the MII oocyte, with which it forms the genotype of an individual. PB1 does not participate in the reproductive process and theoretically contains homologous chromosomes; it is haploid (n), with each homologue chromosome consisting of two sister chromatids (2C). The oocyte of practically all mammalian species is ovulated in metaphase of the second meiosis; it remains in this sequestration until the fertilizing sperm induces the resumption, culmination of meiosis II, remodeling of the sperm chromatin and the beginning of embryonic development. Resolution of oocyte meiosis involves the equal segregation of sister chromatids, generating the second polar body (PB2) and the maternal pronucleus (PNM); both containing a 23,X haplotype. Alternatively to the fertilizing sperm, an efficient and artificial stimulus can induce the oocyte activation response without sperm involvement, allowing the generation of uniparental maternal or parthenogenetic human constructs. Parthenogenetic development, although limited and never giving rise to full-term pregnancies, progresses in early mitosis to give rise to cells, morphologically similar to blastomeres, named parthenocytes. The main objective of this PhD thesis is to develop and validate an oocyte preconception genetic test methodology, in association with monogenic diseases, by means of PB1 biopsy, using the parthenogenetic model. To this end, we set as secondary objectives the development of the PB1 biopsy methodology and assessment of its diagnostic inference capacity by genotyping; quantification that requires the analysis and study of the meiotic triads generated by parthenogenesis (PB1, PB2 and parthenogenote or parthenocyte). The oocytes were obtained from women rejected from the egg donation programme for reproductive purposes, due to their status as heterozygous carriers of a known pathogenic variant. After controlled ovarian stimulation, the oocytes were retrieved, selecting a total of 279 MII. A set of 225 MII, obtained from 6 women, were used for the development of the PB1 biopsy protocol (study 1); 54 MII from two donors were used for the constitution and genetic analysis of the meiotic triads (study 2). These analyzed triads came from oocytes recovered from donor #7; a healthy woman, heterozygous carrier of the pathogenic variant c.1345 C>T (p.Arg499Trp), located in the F9 gene and responsible for hemophilia B. Donor #8 is a healthy woman, also a heterozygous carrier of the c.1521_1523delCTT or dF508 variant (p.Phe508delPhe), located in the CFTR gene and responsible for cystic fibrosis. Throughout the first study, the technical development of the oocyte genetic diagnosis protocol using PB1 analysis has been carried out using fresh oocytes. Currently, its application requires individualized cryopreservation of the biopsied oocytes in order to preserve their viability and competence, while molecular results are obtained. Additionally, in this first study, we decided to include previously cryopreserved MII oocytes; as a possible scenario that included women who, having preserved their fertility, requested genetic diagnosis of their oocytes. In this context, study 1 included fresh biopsied oocytes (group 1); biopsied with subsequent vitrification (group 2) and control (group 3). As for the vitrified oocytes, they were randomized into 4 groups: biopsied (group 4); biopsied with subsequent vitrification (group 5); control of one vitrification (group 6); and control of two rounds of vitrification (group 7); the latter two without PB1 biopsy. Individual vitrification of each oocyte was performed 2 hours after decumulation, or immediately after PB1 biopsy, according to Cryotop® methodology. Cryopreserved oocytes were stored for a maximum of 15 days. After this time, they were devitrified and cultured for 2 hours, at which time their survival was assessed. PB1 biopsy was performed by micromanipulation techniques 2 hours after decumulation in fresh oocytes or after devitrification in cryopreserved oocytes. Depending on the experimental group, 2 hours after devitrification or biopsy of PB1, the number of surviving MII was recorded and artificially activated. Artificial oocyte activation (AOA) consisted of a serial incubation in calcium ionophore (A23187, 5 minutes) and puromycin (5 hours). After this time, oocytes were individually cultured in a time-lapse system, at 37 °C, 6% CO2 and 5% O2 in air and no humidity. After 16-20 hours, those oocytes that extruded the PB2 and showed a single pronucleus (1PN) were counted; normal oocyte activation response (NOAR). In study 2, oocytes with NOAR were additionally selected for biopsy of PB2 and the parthenogenote was then returned to culture. On day 3 of development, those parthenogenotes containing 6 or more cells and less than 15-20% fragmentation were biopsied and the parthenocytes isolated. From each parthenogenote, 1-2 parthenocytes were destined for ploidy analysis by FISH and the remaining parthenocytes were individually included in PCR tubes, as were their respective PB1 and PB2. The identified triads were submitted to the genetic analysis laboratory for genotyping to identify the haplotype associated or not associated with the pathogenic variant in each triad unit. In a first phase of study 1, a total of 68 fresh and 67 cryopreserved oocytes were randomly assigned to the experimental groups. All processed oocytes survived PB1 biopsy and, on average, 95.8% survived vitrification; irrespective of having undergone one or two cryopreservation procedures. However, vitrification of biopsied oocytes resulted in a significant decrease in survival rates, yielding on average 50.9%, regardless of fresh or vitrified origin. The NOAR rate as a diagnostic variable for oocyte competence was variable according to the number of rounds of vitrification rather than the additional application of PB1 biopsy. Fresh oocytes showed a mean NOAR of 70%, which was comparable in all groups, implying that biopsy had no effect on the activation rate. However, the vitrified origin of the oocytes affects the NOAR rate; being more striking if this process is replicated (50% vs. 88.9%; respectively). From the results obtained in this first phase of study 1, it can be deduced that: (i) oocyte survival rates after vitrification are strongly conditioned by the previous biopsy of PB1; (ii) the application of a second round of vitrification does not compromise subsequent oocyte survival; (iii) the biopsy of PB1 does not affect the NOAR rate; (iv) the vitrified origin of the oocytes to be biopsied increases the NOAR rates. In the second phase of study 1, some modifications were made to the biopsy methodology and the AOA protocol. The new protocol was tested on 90 oocytes; 40 of which were of fresh origin and 50 of which were vitrified. Specifically, the modification in the PB1 biopsy protocol consisted of reducing the size of the hole in the zona pellucida from 20-25 µm to 10-15 µm. The modification of the AOA protocol resulted in a reduction of the calcium ionophore (A23187) concentration from 8 µM to 6 µM. These modifications significantly increased the survival of biopsied oocytes to vitrification from 50.9% to 81.8%; no changes were observed in the survival rate of the remaining oocytes cryopreserved in experimental origin (phase 1: 95.8% and phase 2: 87.8%). On the other hand, the NOAR rates increased in all groups, making them equal to the control group; the overall NOAR rate was 80%. Thus, from this first study we can conclude that we have successfully developed the methodology. Study 2 of this PhD thesis aims to validate the methodology, determining the inference of the genetic content of the oocyte from the genetic analysis of the meiotic triads (PB1, PB2 and parthenocytes). For this purpose, we performed an informativity study of donors #7 and #8. For this purpose, we evaluated the suitability of a battery of genetic markers available for the allelic segregation study and to define the phases. After confirmation and characterization of the pathogenic variant, the queried loci were sequenced; the molecular protocol associated with single cell genetic diagnosis was developed. Depending on the donor, genotyping of meiotic triads was carried out with different molecular protocols. In samples from donor #7, a non-specific whole genome amplification (WGA) was performed. This was followed by specific PCR amplification using oligos of the study variant rs757996262 and 2 polymorphisms, rs422187 and rs6048, located on the centromeric side. Subsequently, specific amplification was performed in a first PCR followed by amplification to include the barcodes. The results were then visualised and mass sequencing was performed, allowing the samples to be genotyped. On the other hand, samples from donor #8 were subjected to a first specific amplification by "heminested" PCR of the region where the pathogenic variant is found (dF508) and of the informative and flanking microsatellite markers (D7S633, D7S677, IVS17bTA, IVS8CA, 25xAC, 30xAC, CFTR 18xAC), using fluorescent oligonucleotides. The samples were then electrophoresed and fluorescent detection of the fragments obtained was performed. Finally, bioinformatic analysis was performed using specific software. In addition, microsatellite analysis for ploidy control was also performed on chromosome X (DXS8025, DXS1068) and 18 (D18S61, D18S1127). In this second study, the overall diagnostic efficiency of PB1 depends on several aspects: technical performance and diagnosis. In donor #7, we obtained a complete triad genetic result in 17 out of 25 MII oocytes (yield: 68%); a higher yield than that obtained in donor #8, where 10 triads out of 29 MII oocytes had a complete genetic result (yield: 34.5%). These differences in technical performance seem to be due to the different NOAR rate obtained (96% in donor #7 and 65.5% in donor #8) or to the failure of genetic amplification (16% for donor #7 and 10% in the case of donor #8). In terms of diagnostic yield, the possibility of inferring the oocyte haplotype by studying PB1 is strongly dependent on the degree of heterozygosity of the gene region interrogated, with 41.2% being obtained for the F9 gene and 90% for the CFTR gene; ultimately resulting in the expected and observed proportion of wild-type and pathogenic variants according to the principles of mendelian segregation. The observed differences in the degree of heterozygosity may depend on the molecular analysis protocol used. However, the detection of a heterozygous PB1 can be attributed either to recombination of the allele under study or to an abnormal segregation pattern, namely an early separation of the sister chromatids in meiosis I. The origin of this heterozygosity, although it cannot be clarified with the molecular approach executed here, we believe that recombination is the most likely origin. Due to the high rate of PB1 heterozygosity, inference of oocyte gene content by PB1 was possible in just over half of the donor #7 oocytes, yielding a sensitivity and specificity of 80%. However, in donor #8 we were only able to infer oocyte haplotype in one case (10%) due to the high rate of PB1 heterozygosity. Therefore, although biopsy and analysis of PB1 is technically possible, the low diagnostic yield obtained questions its possible clinical translation; it is necessary to complete this information with that derived from PB2. In our particular case, this double information increased the sensitivity and specificity to almost 90% for donor #7 and 100% for donor #8. Finally, and as a consequence of the study of the third meiotic unit, we propose a new strategy: the direct study (and not by inference) of the element that participates in fertilization in a new format, the parthenocyte. After AOA and culture, parthenogenotes contain an average of seven parthenocytes; the genotype of all of them being identical; they are, a priori, clones of the maternal pronucleus. Thus, we wondered whether parthenogenesis would in itself constitute a gametic cloning method and, therefore, a novel and transgressive approach to preconception genetic diagnosis, which would allow the selection of those maternal origins free of aneuploidy or with a specific genotype for future and subsequent fertilization.	en_US
dc.description.abstract	El desarrollo de nuevas tecnologías de cribado genético informa que la mayoría de la población es portadora, en heterocigosis, de alguna variante patogénica causante de enfermedades monogénicas; generando la mitad de sus gametos libres de la mutación y la otra mitad portadores. En el ámbito de la reproducción humana asistida, el diagnóstico molecular de los ovocitos permitiría seleccionar aquéllos libres de una variante patogénica particular, previamente a la fecundación; maximizando las probabilidades de obtener descendencia sana o portadora, según el escenario particular de cada pareja. Actualmente, el estudio molecular directo del ovocito fecundable no es posible, ya que su diagnóstico implica su compromiso en viabilidad. Alternativamente, la inferencia diagnóstica es posible mediante estudio del primer corpúsculo polar (CP1): una pequeña estructura, rodeada de membrana y con escaso citoplasma, localizada en el espacio perivitelino del ovocito maduro MII; es resultado de la primera división reduccional de la meiosis, presentando un haplotipo alélicamente complementario a la información contenida en el ovocito MII, con la que forma el genotipo de un individuo. El CP1 no participa en el proceso reproductivo y contiene, teóricamente, cromosomas homólogos; siendo haploide (n), y estando cada homólogo constituido por dos cromátidas hermanas (2C). El ovocito de prácticamente todas las especies de mamífero es ovulado en metafase de la segunda meiosis; permaneciendo en dicho secuestro hasta que el espermatozoide fecundante induzca la reanudación, culminación de la meiosis II, remodelación de la cromatina espermática y el inicio del desarrollo embrionario. La resolución de la meiosis ovocitaria comprende la segregación equitativa de las cromátidas hermanas, generando el segundo corpúsculo polar (CP2) y el pronúcleo materno (PNM); ambos conteniendo un haplotipo 23,X. Alternativamente al espermatozoide fecundante, un estímulo eficiente y artificial puede inducir la respuesta ovocitaria de activación sin participación espermática; permitiéndose la generación de constructos humanos uniparentales maternos o partenogenotas. El desarrollo partenogenético, aunque limitado y no dando en ningún caso gestaciones a término, progresa en las mitosis iniciales dando lugar a células, morfológicamente similares a las blastómeras, denominadas partenocitos. La presente tesis doctoral tiene como objetivo principal poner a punto y validar una metodología de test genético preconcepción (TGPC) ovocitario, en asociación a enfermedades monogénicas, mediante biopsia del CP1, empleando el modelo partenogenota. Para ello, planteamos como objetivos secundarios la puesta a punto de la metodología de biopsia de CP1 y valoración de su capacidad de inferencia diagnóstica mediante genotipado; cuantificación que requiere del análisis y estudio de las tríadas meióticas generadas por partenogénesis (CP1, CP2 y partenogenota o partenocito). Los ovocitos se obtuvieron de mujeres rechazadas del programa de donación de óvulos con fines reproductivos, debido a su condición de portadoras en heterocigosis de alguna variante patogénica conocida. Tras la estimulación ovárica controlada, los ovocitos se recuperaron, seleccionando un total de 279 MII. Un conjunto de 225 MII, obtenidos de 6 mujeres, se destinaron a la puesta a punto del protocolo de biopsia de CP1 (estudio 1); por su parte, 54 MII de dos donantes fueron empleados para la constitución y análisis genético de las tríadas meióticas (estudio 2). Estas tríadas analizadas proceden de ovocitos que fueron recuperados de la donante #7; una mujer sana, portadora en heterocigosis de la variante patogénica c.1345 C>T (p.Arg499Trp), localizada en el gen F9 y responsable de la hemofilia B. Por su parte, la donante #8 es una mujer sana, portadora igualmente en heterocigosis de la variante c.1521_1523delCTT o variante dF508 (p.Phe508delPhe), localizada en el gen CFTR y responsable de la fibrosis quística. A lo largo del primer estudio, el desarrollo técnico del protocolo de diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del CP1 se ha llevado a cabo empleando ovocitos frescos. Actualmente, su aplicación requiere de la criopreservación individualizada de los ovocitos biopsiados a fin de preservar su viabilidad y competencia, en tanto que se obtienen los resultados moleculares. Adicionalmente, en este primer estudio, decidimos incluir ovocitos MII previamente criopreservados; como aquél posible escenario que incluyera mujeres que, habiendo preservado su fertilidad, solicitaran el diagnóstico genético de sus ovocitos. En este contexto, el estudio 1 incluyó ovocitos frescos biopsiados (grupo 1); biopsiados con posterior vitrificación (grupo 2) y control (grupo 3). Por lo que respecta a los ovocitos vitrificados, se aleatorizaron en 4 grupos: biopsiados (grupo 4); biopsiados con posterior vitrificación (grupo 5); control de una vitrificación (grupo 6); y control de dos rondas de vitrificación (grupo 7); estos dos últimos sin biopsia de CP1. La vitrificación individual de cada ovocito se realizó 2 horas después de la decumulación, o bien inmediatamente después de la biopsia de CP1, según la metodología de Cryotop®. Los ovocitos criopreservados fueron almacenados por un máximo de 15 días. Tras este tiempo, se desvitrificaron siguiendo también la metodología de Cryotop® y cultivados por 2 horas, momento en que se evaluó su supervivencia. La biopsia de CP1 se realizó mediante técnicas de micromanipulación 2 horas tras la decumulación en los ovocitos frescos o tras la desvitrificación en aquéllos criopreservados. En función del grupo experimental, 2 horas después de la desvitrificación o biopsia del CP1, el número de MII supervivientes fue registrado y artificialmente activados. La activación ovocitaria artificial (AOA) consistió en una incubación seriada en ionóforo de calcio (A23187, 5 minutos) y puromicina (5 horas). Transcurrido este tiempo, los ovocitos fueron individualmente cultivados en sistema time-lapse, a 37 ºC, 6% CO2 y 5% de O2 en aire y sin humedad. Tras 16-20 horas, se contabilizaron aquéllos ovocitos que además de haber expulsado el CP2 presentaban un único pronúcleo (1PN); respuesta de activación ovocitaria normal (NOAR). En el estudio 2, adicionalmente, se seleccionaron aquéllos ovocitos con NOAR para biopsiar el CP2, devolviendo a continuación el partenogenota al cultivo. En día 3 de desarrollo, el cultivo cesó y aquéllos partenogenotas que contuviesen 6 o más células y menos de un 15-20% de fragmentación fueron biopsiados y los partenocitos aislados. De cada partenogenota, 1-2 partenocitos se destinaron al análisis de ploidía mediante FISH y los restantes partenocitos fueron individualmente incluidos en tubos de PCR, al igual que sus respectivos CP1 y CP2. Las tríadas identificadas fueron remitidas al laboratorio de análisis genético para su genotipado, a fin de identificar el haplotipo asociado o no asociado a la variante patogénica en cada unidad de la tríada. En una primera fase del estudio 1, un total de 68 ovocitos frescos y 67 criopreservados fueron aleatoriamente asignados a los grupos experimentales. Todos los ovocitos procesados sobrevivieron a la biopsia del CP1 y, en promedio, 95,8% sobrevivieron a la vitrificación; independientemente de haber experimentado uno o dos procedimientos de criopreservación. Sin embargo, la vitrificación de ovocitos biopsiados supuso una merma significativa en las tasas de supervivencia, rindiendo en promedio un 50,9%, independientemente del origen fresco o vitrificado. Por su parte, la tasa de NOAR como variable diagnóstica de competencia ovocitaria fue variable en función del número de vitrificaciones más que de la aplicación adicional de la biopsia de CP. Los ovocitos frescos mostraron una media de NOAR del 70%, comparable en todos los grupos; lo que implica que la biopsia no ejerce ningún efecto sobre la tasa de activación. No obstante, el origen vitrificado de los ovocitos afecta a la tasa de NOAR; siendo más llamativa si se replica este proceso (50% vs. 88,9%; respectivamente). De los resultados obtenidos en esta primera fase del estudio 1 se deduce que: (i) las tasas de supervivencia ovocitaria a la vitrificación están fuertemente condicionadas por la previa biopsia del CP1; (ii) la aplicación de una segunda vitrificación no compromete la ulterior supervivencia ovocitaria; (iii) la biopsia de CP1 no afecta a la tasa de NOAR; (iv) el origen vitrificado de los ovocitos a biopsiar, aumenta las tasas de NOAR. En la segunda fase del estudio 1, se incluyeron algunas modificaciones en la metodología de biopsia y en el protocolo de AOA. El nuevo protocolo fue testado en 90 ovocitos; siendo 40 de ellos de origen fresco y 50 vitrificados. Concretamente, la modificación en el protocolo de biopsia de CP1 consistió en disminuir el tamaño del orificio practicado en la zona pelúcida de 20-25 µm a 10- 15 µm. Por su parte, la modificación en el protocolo de AOA conllevó una reducción en la concentración de ionóforo de calcio (A23187) de 8 µM a 6 µM. Estas modificaciones incrementaron notablemente la supervivencia de los ovocitos biopsiados a la vitrificación, pasando de un 50,9% a un 81,8%; no observándose modificaciones en la tasa de supervivencia en el resto de ovocitos criopreservados en origen experimentales (fase 1: 95,8% y fase 2: 87,8%). Por otro lado, aumentaron las tasas de NOAR en todos grupos, equiparándolas al grupo control; siendo la tasa de NOAR global del 80%. Así, de este primer estudio podemos concluir que hemos logrado con éxito poner a punto la metodología del TGPC ovocitario. El estudio 2 recogido en esta tesis doctoral tiene por objeto la validación del TGPC ovocitario, determinando la inferencia del contenido genético del ovocito a partir del análisis genético de las tríadas meióticas (CP1, CP2 y partenocitos). Para ello, realizamos un estudio de informatividad de las donantes #7 y #8. A tal efecto, se evaluó la idoneidad de la batería de marcadores genéticos disponible para el estudio de segregación alélica y definir las fases. Tras la confirmación y caracterización de la variante patogénica, se secuenciaron los loci interrogados; se desarrolló el protocolo molecular asociado al diagnóstico genético en célula única. Según la donante, el genotipado de las tríadas meióticas se llevó a cabo con diferentes protocolos moleculares. En las muestras procedentes de la donante #7, portadora de la variante patogénica en F9, se realizó una amplificación inespecífica de todo el genoma (WGA). A continuación, una amplificación específica por PCR mediante oligos de la variante de estudio rs757996262 y 2 polimorfismos, rs422187 y rs6048, localizados en el lado centromérico. Posteriormente, se realizó una amplificación específica en una primera PCR seguida de una amplificación para incluir los barcodes. Seguidamente se visualizaron los resultados y se realizó la secuenciación masiva, permitiendo proceder al genotipado de las muestras. Por otra parte, las muestras de la donante #8, portadora de la variante responsable de la fibrosis quística, se sometieron a una primera amplificación específica mediante PCR “heminested” de la región donde se encuentra la variante patogénica (dF508) y de los marcadores microsatélite informativos y flanqueantes a ella (D7S633, D7S677, IVS17bTA, IVS8CA, 25xAC, 30xAC, CFTR 18xAC), utilizando oligonucleótidos fluorescentes. A continuación, se realizó la electroforesis de las muestras y la detección fluorescente de los fragmentos obtenidos. Por último, se procedió al análisis bioinformático mediante un software específico. Además, también se realizó un análisis de microsatélites para control de ploidía en el cromosoma X (DXS8025, DXS1068) y 18 (D18S61, D18S1127). En este segundo estudio, la eficiencia global diagnóstica del CP1 depende de varios aspectos: el rendimiento técnico y el diagnóstico. En la donante #7, obtuvimos resultado genético de la tríada completa en 17 de los 25 ovocitos MII (rendimiento: 68%); un rendimiento superior al obtenido en la donante #8, donde 10 tríadas de 29 ovocitos MII tuvieron resultado genético completo (rendimiento: 34,5%). Estas diferencias en el rendimiento técnico parecen deberse a la diferente tasa de NOAR obtenida (96% en la donante #7 y 65,5% en la donante #8) o al fallo de amplificación genética (16% para la donante #7 y del 10% en el caso de la donante #8). Por lo que respecta al rendimiento diagnóstico, la posibilidad de inferir el haplotipo ovocitario mediante estudio del CP1, es fuertemente dependiente del grado de heterocigosidad de la región génica interrogada, habiéndose obtenido un 41,2% para el gen F9 y un 90% para el gen CFTR; resultando, en última instancia, la proporción esperada y observada de las variantes wild-type y patogénicas según los principios de segregación mendeliana. Las diferencias observadas en el grado de heterocigosidad pueden depender del protocolo de análisis molecular utilizado. No obstante, la detección de un CP1 heterocigoto puede atribuirse a la recombinación del alelo estudiado o bien a un patrón de segregación anómala, concretamente una separación precoz de las cromátidas hermanas en la meiosis I. El origen de esta heterocigosidad, si bien no puede esclarecerse con la aproximación molecular aquí ejecutada, creemos que la recombinación es el origen más probable. Debido a la elevada tasa de heterocigosidad del CP1, la inferencia del contenido genético del ovocito mediante el CP1 fue posible en poco más de la mitad de los ovocitos de la donante #7, rindiendo una sensibilidad y especificidad del 80%. Sin embargo, en la donante #8 solamente pudimos inferir el haplotipo ovocitario en un caso (10%) debido a la elevada tasa de heterocigosidad de CP1. Por tanto, aunque la biopsia y análisis de CP1 es técnicamente posible, el escaso rendimiento diagnóstico obtenido cuestiona su posible traslación clínica; siendo necesario completar dicha información con aquélla derivada del CP2. En nuestro caso particular, esta doble información aumentó la sensibilidad y especificidad a casi el 90%, para la donante #7; y el 100% para la donante #8. Finalmente, y consecuencia del estudio de la tercera unidad meiótica, planteamos una nueva estrategia: el estudio directo (y no por inferencia) del elemento partícipe de la fecundación en un nuevo formato, el partenocito. Tras la AOA y cultivo, los partenogenotas contienen una media de siete partenocitos; siendo el genotipo de todos ellos idéntico; resultando ser, a priori, réplicas del pronúcleo materno. De este modo, nos planteamos si la partenogénesis constituiría en sí misma un método de clonación gamética y, por tanto, un novedoso y transgresor abordaje de diagnóstico genético preconcepción, que permitiría seleccionar aquéllos orígenes maternos exentos de aneuploidías o con un determinado genotipo para una futura y ulterior fecundación.	es_ES
dc.format.extent	246 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	embriología	es_ES
dc.subject	genética humana	es_ES
dc.subject	ovocito	es_ES
dc.subject	partenogenota	es_ES
dc.subject	meiosis	es_ES
dc.subject	diagnóstico genético	es_ES
dc.subject	corpúsculo polar	es_ES
dc.subject	partenocito	es_ES
dc.subject	fecundación	es_ES
dc.title	Diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del primer corpúsculo polar	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Biología humana ::Embriología humana	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Biología humana ::Genética humana	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Genética ::Embriología	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES
dc.rights.accessRights	open access	es_ES