Lung cancer is the leading cause of cancer death worldwide. Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) represents a high percentage of all lung tumours. Nowadays there are drugs and therapies aimed at the cancer subtype or driver mutations. These directed therapies were possible thanks to a deeper genome knowledge and advances on gene mutation screening. In lung cancer, survival is still low due to most patients not being able to benefice from directed therapy and chemotherapy treatments failing frequently. One of the factors that may be contributing to this outcome is the cancer stem cell population (CSC) in the tumour. CSC are believed to be responsible for the aggressiveness and cancer progression. This thesis focused on the identification and characterization of CSC subpopulations in NSCLC. We have used the ATCC cell lines A549, H1395, H1650, H1993 and PC9; and we have also stablished our own lines, derived from NSCLC resected tumour. We have developed a methodology to grow tumorospheres, a culture enriched in CSC. Thanks to injections in immunocompromised mice, we were able to confirm the tumor-initiating ability, an important CSC trait. We were able to identify potential CSC markers comparing the multiparametric flow cytometry of monolayer and tumorspheres cultures. Using Multiparametric flow cytometry we studied CMT markers from resected tumours. Despite the present high variability, some of the CSC potential markers were correlated with clinicopathological variables, but these results need to be validated in larger cohorts. Our results identify potential CSC markers in NSCLC and their signalling pathways. In particular EpCAM shows the activation of a signal transduction pathway in tumorospheres of our established lines. Thanks to gene analysis techniques, we identified 6 genes, CD44, NOTCH3, ITGA6, NANOG, P21 y SNAI1, overexpressed on our stablished lines’ tumorospheres, which we hope will be useful for the identification of CSC population in adenocarcinoma.El carcinoma pulmonar es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa un alto porcentaje del total de todos los tumores de pulmón. Hoy en día en la clínica existen fármacos y estrategias terapéuticas dirigidas para tratar a los pacientes según el subtipo o mutaciones conductoras del tumor. Estas terapias dirigidas han sido posibles gracias al mayor conocimiento del genoma, así como de mejoras en las técnicas de identificación de las mutaciones génicas. La supervivencia del cáncer de pulmón sigue siendo baja ya que la mayoría de los pacientes no pueden beneficiarse de una terapia dirigida y el fracaso en los tratamientos de quimioterapia son frecuentes. Uno de los factores que puede contribuir a este fracaso es la existencia de una subpoblación de células madre tumorales (CMT) en el tumor. Las CMT se creen en gran parte responsables de la agresividad y progresión del cáncer. Esta tesis se centra en la identificación y caracterización de subpoblaciones de CMT en el CPNM. Hemos usado una colección de líneas celulares establecidas como son las A549, H1395, H1650, H1993 y PC9, pero también líneas celulares derivadas de tumores de pacientes (LDP) con CPNM establecidas en nuestro laboratorio a partir de la disgregación de tumores primarios de pacientes. Hemos puesto a punto una metodología para la formación de tumoroesferas enriquecidas en poblaciones de CMT. Ensayos de inyección de células en ratones inmunocomprometidos permitieron la evaluación de la capacidad iniciadora de tumores (CIT) de las tumoroesferas, confirmando su característica de CMT. Se han realizado ensayos de citometría multiparamétrica de poblaciones de tumoroesferas comparados con cultivos tradicionales en monocapa que permiten la identificación de potenciales marcadores de CMT. Mediante citometría de flujo ha analizado marcadores de CMT en células provenientes de la disgregación de tumores primarios de CPNM recién resecados. Estos tumores primarios muestran una enorme variabilidad, pero a pesar de esta, algunos de los potenciales marcadores de CMT se han relacionado con variables clínico-patológicas, aunque estos resultados deberán ser validados en cohortes de pacientes mayores. Los resultados obtenidos identifican posibles marcadores de CMT en CPNM y sus vías de señalización. En concreto, el marcador de superficie EpCAM muestra la activación de una ruta de transducción de señales en las tumoroesferas de las LDPs. Un análisis génico identificó una firma de 6 genes, CD44, NOTCH3, ITGA6, NANOG, P21 y SNAI1, que se encuentran sobreexpresados en las esferas de las LDP y que podrían ser de utilidad para la identificación de poblaciones de CMT en el adenocarcinoma pulmonar.