$1000 M and 10 years approximately are the economic and time cost of bringing a new medicine to the market. Because of this, new approaches and methodologies have been and are being used to increase the efficiency of the drug development process, and among them model-informed drug discovery and development has positioned as more than a valuable tool to achieve such a goal. Modelling and simulation strategies are a powerful resource to increase the efficiency in the drug discovery and development process. Under the umbrella of pharmacometrics, one of the disciplines with the greatest growth and recognition in recent years has been physiologically based pharmacokinetic (PBPK) modelling. A PBPK model is a mathematical structure defining an organism (the system) and build up with anatomically differentiated compartments representing organs and tissues, all of them connected through the cardiovascular system by means of arterial and venous blood flows. The unique strengths of PBPK modelling and simulation are its mechanistic approach to the absorption, distribution, metabolism and excretion of a drug, its ability to integrate different type of data (the physiology of the system, the drug’s properties, the demographic characteristics of the population as well as the trial design) and of course, its ability to predict the drug’s concentration and the target tissue, which is one of the main features of this modelling approach. Able to differentiate system- and drug-related parameters, PBPK allows to “easily” develop mechanistic models to check untested or untestable scenarios and to answer “what-if” questions in the safest possible way. Open software and designed modelling software tools do exist to develop PBPK models, being the latter necessarily qualified for its purpose. Because of its algorithmic nature, these software need systems of ordinary differential equations defining local processes and relation among the tissues/organs that ultimately constitute the system/organism. And these equations must be defined from scratch by the modeller or by the designer. The present Thesis will start with the validation of a multilevel object-oriented and acausal (non-algorithmic) modelling methodology and will be proposed as an alternative to algorithmic methodologies because of its re-usability (object-oriented) and comfort (no need to define ordinary differential equations systems) for the modeller. In the second part of the Thesis, preclinical utility of PBPK modelling will be highlighted through the development of a PBPK/pharmacodynamic model for the small molecule MBQ-167 to predict tumour growth inhibition for two breast cancer cell lines (i.e., HER2 positive and triple negative) in mice. Additionally, model simulations will be performed to explore the effect of more intensive dosing regimens in tumour size reduction. After an extensive review of the pharmacokinetic parameters driving atorvastatin absorption, distribution, metabolism and excretion processes, the development of a PBPK model for atorvastatin and its metabolites to in silico assess the drug-gene interaction with SLCO1B1 polymorphisms will be presented, moving the application of PBPK modelling and simulations to the clinical setting. Finally, the last part of the present Thesis will focus on the PBPK modelling of large molecules in oncology by means of the development of PBPK models for the monoclonal antibodies directed to EGFR family membrane receptors pertuzumab, trastuzumab, and cetuximab.--Introducció Quan parlem de models farmacocinètics basats en la fisiologia (PBPK per les seues sigles en anglès) parlem d’estructures matemàtiques definint un organisme (el sistema) i construïdes amb una sèrie de compartiments diferenciats que representen òrgans i teixits, tots ells connectats per fluxos sanguinis arterials i venosos. Aquest tipus de models contenen tota una representació directa dels òrgans més rellevants per als processos d’Absorció, Distribució, Metabolisme i Excreció (ADME) d’un fàrmac, essent els més habituals pulmons, cervell, cor, fetge, tracte gastrointestinal (GI), pàncrees, melsa, gònades, ronyons, pròstata, músculs, teixit adipós, tim, ossos i pell. Cadascun d’aquests teixits i òrgans està caracteritzat pel seu volum, flux sanguini i composició (volums fraccionals d’aigua, fosfolípids, i lípids neutres i la fracció intersticial), amb diferent estructures internes que van des de la més simple (el teixit com a un tot) a altres més complexes amb espais vascular, intersticial i intracel·lular o també arribant a tenir en compte l’espai endosomal (molt apropiat quan es treballa amb fàrmacs biològics). A més a més, informació addicional com abundàncies enzimàtiques i de transportadors de membrana, hematòcrit, pH i temps de buidat gàstrics, filtració glomerular, hepatocel·lularitat (milions de cèl·lules hepàtiques per gram de teixit hepàtic), pH plasmàtic, dimensions del tracte GI (radi i llargària) s’han de tenir en compte per a poder definir de la millor manera possible la fisiologia d’aquests òrgans. A banda d’aquestes característiques fisiològiques, informació demogràfica com l’edat, el pes, l’alçada i el gènere és afegida al model PBPK per tal de completar la parametrització de l’organisme. Cas que la variabilitat interindividual en tots aquests paràmetres siga coneguda i estiga quantificada es pot arribar a generar una població virtual per tal de representar escenaris més realistes, passant a parlar-se de PBPK poblacional o popPBPK. Afegits al bloc del sistema, es necessiten dos blocs més per a generar l’entramat que constituirà el model PBPK. El primer és el fàrmac. La incorporació de propietats fisicoquímiques com el pes molecular, estructura química, caràcter àcid o bàsic i la lipofília, així com la fracció lliure en plasma (fu), coeficients de partició sang/plasma (B/P) i teixit/plasma (Kpt), aclariments intrínsecs (CLint) per a processos metabòlics i de transport actiu, i excreció renal i/o biliar com a paràmetres de l’ADME constitueixen els paràmetres del model PBPK relacionats amb el fàrmac. Per últim, la forma farmacèutica a estudiar (comprimit, solució oral, etc.), el disseny de l’estudi (dosi i esquema d’administració, duració, etc.) així com esdeveniments particulars (ingesta d’aliments, per exemple) defineixen el bloc de paràmetres relacionats amb l’assaig clínic o preclínic. Aquesta diferenciació per blocs és necessària per a poder desenvolupar models genèrics i independents i utilitzar-los en una àmplia varietat d’escenaris. És a dir, el fàrmac X (amb la seua parametrització) podrà ser avaluat en la població Y (amb les seues característiques) amb un disseny experimental (dosi i freqüència d’administració) particular però, sobretot, flexible. O expressat d’altra manera: poder arribar a respondre preguntes de l’estil “què passaria si...?”. L’ús del modelat PBPK en el procés de descobriment i desenvolupament de medicaments ha estat limitat en el passat degut a la complexitat d’aquests models i la gran quantitat de dades que són necessàries per a desenvolupar-los. La disponibilitat de determinades tècniques experimentals i sistemes in vitro que permeten la determinació indirecta d’alguns processos de l’ADME, així com la millora de les tècniques d’extrapolació in vitro-in vivo (IVIVE) i de mètodes de predicció dels coeficients de partició B/P i Kpt o de la permeabilitat intestinal efectiva en humans (Peff,man) ha fet possible la combinació de tots aquests paràmetres que venen de fonts diferents (prediccions in silico, experiments in vitro o determinacions in vivo) en models fisiològics per tal de predir perfils de concentració en funció del temps en plasma sanguini o determinats teixits d’una manera mecanística, també conegut baix el terme anglosaxó aproximació “bottom-up”. Aquesta metodologia mecanística de modelat difereix de les tècniques més convencionals d’anàlisi de dades o aproximacions “top-down”, amb les quals els models farmacocinètics es desenvolupen un cop els valors de concentració en funció del temps estan disponibles. Un avantatge de les aproximacions “bottom-up” (i per tant dels models PBPK) que es pot deduir ràpidament és que el treball de modelat i simulació (M&S) pot començar ben prompte en el procés de desenvolupament de medicaments, quan aquests valors de concentració encara no hi estan disponibles. No obstant això, no es pretén que ambdues tècniques siguen incompatibles, ja que la informació que proporcionen es pot utilitzar per reforçar-se mútuament. Aquesta simbiosi és el que es coneix baix el terme d’aproximacions “middle-out”. El modelat i simulació fisiològic és una tècnica potent (i sobretot, eficient) per tal d’accelerar la transició entre les diferents fases del procés de desenvolupament de medicaments i avaluar l’efecte de factors intrínsecs (insuficiències orgàniques, edat, embaràs, etc.) i extrínsecs (interaccions entre fàrmacs o DDIs, tabaquisme, etc.), aïllades o en combinació, sobre l’exposició al fàrmac en qüestió. El modelat i simulació en PBPK pot ajudar en el disseny d’un assaig clínic i reduir els temps de decisió interna, així com també rebaixar la incertesa de les agències reguladores de medicaments. L’increment en l’ús del modelat PBPK per la indústria farmacèutica en els darrers anys i la inclusió cada vegada més freqüent de resultats derivats d’aquestes aproximacions a les sol·licituds d’autorització per a la comercialització de medicaments ha ocasionat el reconeixement i l’acceptació per part de les principals agències reguladores (European Medicines Agency [UE], Food and Drug Administration [EEUU], Pharmaceuticals and Medicals Devices Agency [Japó]) i la publicació de guies de bones pràctiques en modelat PBPK per tal d’estandarditzar els informes presentats, traslladant el modelat i la simulació PBPK de la curiositat acadèmica a la pràctica habitual per la indústria farmacèutica i l’acceptació a nivell regulador. Tant és així, que aquest tipus de simulacions han servit no sols per informar fitxes tècniques de medicaments (posologia, risc de DDIs, ús en poblacions específiques com malaltia renal o insuficiència hepàtica), sinó que han arribat a substituir la realització de determinats assajos clínics; situacions que d’altra manera hagueren ocasionat un buit terapèutic en una situació específica. El desenvolupament de programes informàtics sofisticats i potents que són capaços d’integrar i combinar d’una manera eficient l’estructura fisiològica d’un organisme, les propietats fisicoquímiques i de l’ADME del fàrmac i el disseny de l’estudi ha suposat un punt d’inflexió per a la difusió i acceptació dels models PBPK. Ajudant-se d’una interfície gràfica i col·leccions de poblacions i fàrmacs, el principal avantatge d’aquestes eines informàtiques és que poden ser utilitzats per professionals que dominen els principis fisiològics i farmacocinètics però, que manquen de l’experiència necessària per a la codificació d’aquestes estructures matemàtiques des de zero. Entre els programes informàtics més àmpliament utilitzats en aquest sector cal destacar SimCYP® (Certara), PK-Sim® (Open Systems Pharmacology) i GastroPlus® (Simulation Plus). En aquests programes, l’estructura bàsica del model PBPK està prèviament definida pels seus desenvolupadors i per tant, no és accessible per a l’usuari final. Açò no vol dir que aquests programes no siguen transparents, ja que habitualment se’ls anomena “caixes negres” per aquest “blindatge” que porten per defecte. En realitat, totes les assumpcions en què es basen estan clarament definides i disponibles per a l’usuari. És per això que, el terme “caixes de cristall” recentment definit, potser encaixa millor en la definició d’aquests programes. És més, aquesta inaccessibilitat ha de ser interpretada en termes de qualitat, ja que tan sols uns pocs especialistes (i experts) poden obrir aquesta “caixa”, accedir a l’estructura del model, fer els canvis i millores que corresponguen i requalificar el programa per mantenir la confiança en els resultats que proporciona. Tots aquests programes es basen en sistemes d’equacions diferencials ordinàries (ODE) que bé siga l’usuari final o el desenvolupador ha de definir per a poder descriure els processos locals i les relacions entre compartiments (o teixits/òrgans en el nostre cas). No obstant això, altres metodologies hi existeixen, com programes basats en sistemes d’equacions diferencials algebraiques i tecnologia de “machine learning” acausal. El principal avantatge d’aquests llenguatges de simulació és que la descripció matemàtica dels components de simulació no és algorítmica (acausal) i per tant, les variables d’entrada i eixida no tenen per què definir-se en la fase inicial de construcció del model. --Hipòtesi i objectius Més enllà de la necessitat constant d’avançar en la millora de les tècniques d’extrapolació in vitro-in vivo i en la recopilació de dades fisiològiques per perfeccionar la caracterització virtual dels essers vius, existeix també una necessitat de perfeccionar i refinar la utilització del modelat farmacocinètic fisiològic en el procés de desenvolupament de medicaments informat per models. A més a més, els treballs d’investigació que han analitzat els principals programes informàtics de modelat farmacocinètic fisiològic han estat centrats en els mecanismes fisiològics integrats, les característiques de modelat que satisfan els requeriments dels usuaris i de les agències reguladores de medicaments, així com la capacitat d’abordar poblacions especials o avaluar interaccions entre fàrmacs, però no en els aspectes metodològics en què es basen. Per tot el descrit anteriorment, l’objectiu principal de la present Tesi doctoral és: Desenvolupar, validar i aplicar models farmacocinètics fisiològics des d’un punt de vista metodològic i de presa de decisions i enfocat a optimitzar el procés de descobriment i desenvolupament de medicaments informat per models. En particular, els objectius específics són: 1. Avaluar la capacitat predictiva del programa per a modelat i simulació fisiològiques PhysPK front al software de referència més emprat en farmacocinètica poblacional NONMEM. 2. Comparar les metodologies de modelat causal i acausal en un model farmacocinètic semimecanístic. 3. Caracteritzar la dinàmica de creixement tumoral de dos línies humanes de càncer de pit (HER2+ i Triple Negativa). 4. Desenvolupar un model PBPK/farmacodinàmic per al fàrmac MBQ-167 administrat per via intraperitoneal en ratolins. 5. Desenvolupar un model PBPK per a l’atorvastatina i els seus principals metabòlits en forma àcida i lactonitzada. 6. Avaluar quantitativament l’impacte dels polimorfismes genètics al gen SLCO1B1 en la farmacocinètica de l’atorvastatina. 7. Proposar una estratègia general per al modelat PBPK d’anticossos monoclonals i la seua aplicació en l’àmbit de la farmacologia clínica per a optimitzar l’expressió de la diana terapèutica al lloc d’acció i també mecanismes d’eliminació d’aquests fàrmacs biològics. --Resultats i discussió -Part 1: aspectes metodològics dels programes informàtics per a modelat farmacocinètic fisiològic En aquesta part es resolen els obejctius específics 1 i 2. Agafant com a referència un model teòric semimecanístic que incorporava un procés d’absorció complex per administració oral d’una forma farmacèutica sòlida, trànsit intestinal, dissolució del fàrmac limitada per la seua solubilitat, transportadors de secreció intestinal activa amb expressió variable al llarg del tracte GI, metabolisme intestinal i hepàtic, tres versions del fàrmac administrat per via oral (primera generació o PD i dos metabòlits, PM i SM), i excreció renal dels metabòlits, es van generar quatre versions o aproximacions a aquesta estructura bàsica teòrica: ● vNM: versió semimecanística descrita amb un sistema d’ODEs al programa NONMEM i definint el metabolisme de PD amb taxes d’extracció. ● vPSEM: versió idèntica a vNM però, definida al programa PhysPK. ● vPSIM: versió semimecanística descrita amb un sistema d’ODEs al programa PhysPK i definint el metabolisme de PD amb aclariments intrínsecs. ● vPPK: versió fisiològica i multinivell del model teòric definida a PhysPK. Aquesta versió fa ús de la metodologia de modelat acausal i orientat a objectes. Finalment, es va generar un set de 32 escenaris incloent fàrmacs de classe BCS II i IV, dos nivells de dosi, i metabolisme (intestinal i hepàtic) i activitat de la glicoproteïna P (P-gp) lineal i no lineal. Aquesta bateria d’escenaris es va sotmetre a una avaluació per mitjà de diferents comparacions de les versions del model teòric descrites anteriorment. -Validació del programa PhysPK: vNM vs vPSEM L’avaluació gràfica dels perfils concentració plasmàtica en funció del temps (Cp-t) generats amb PhysPK són pràcticament idèntics als obtinguts amb NONMEM per a PD en tots els escenaris considerats. La correspondència entre programes per a PM i SM és bona per a valors baixos-mitjos de concentració, i lleugerament diferent per a valors alts de concentració (prop de la concentració plasmàtica màxima o Cmax) als escenaris corresponents a una baixa permeabilitat intestinal i una activitat lineal de la P-gp. No obstant, el coeficient de correlació lineal (R2) va resultar superior a 0.96 en tots els casos i amb errors relatius (RE) mitjos inferiors al 7% per a l’àrea baix la corba Cp-t (AUC) i inferiors al 3% per a Cmax. -Avaluació del metabolisme: vPSEM vs vPSIM En aquesta fase es va dur a terme la comparació de dues versions del model teòric, ambdues definides al programa PhysPK, diferenciant-se únicament en l’abordatge del metabolisme de PD (taxes d’extracció vs aclariment intrínsec). De la manera com s’esperava, PD va resultar la versió del fàrmac més sensible als canvis en el metabolisme. La saturació del metabolisme hepàtic comporta una disminució en la velocitat d’eliminació, fent més gran la diferència en AUC i Cmax entre versions degut a la manera com està parametritzat el metabolisme en ambdues versions. -Comparació de metodologies: vPSIM vs vPPK Els resultats de la comparació de les versions PSIM i PPK van revelar una correspondència excel·lent entre ambdues aproximacions en la predicció de l’exposició a PD, sense cap tendència d’infrapredicció o sobrepredicció en cap escenari, i amb RE mitjos en la predicció d’AUC i Cmax del -0.02% i -0.04%, respectivament. Quant als metabòlits PM i SM, la determinació de diferències significatives entre ambdues versions és deguda a la falta de perfusió sanguínia en la vPSIM, en la que PM i SM són disposats immediatament als seus compartiments un cop formats. A la vPPK, més fisiològica, les prediccions de la concentració plasmàtica de PM i SM van resultar superiors a les obtingudes amb la vPSIM perquè tant PM com SM circulen pel torrent sanguini abans de ser excretats amb la orina, fenòmen que ocorre immediatament a la versió PSIM tan prompte com s’han format, predient-se una exposició menor a la que fisiològicament té lloc. -Part 2: modelat farmacocinètic fisiològic al context preclínic Aquesta part dóna resposta als objectius específics 3 i 4. La molècula de síntesi MBQ-167 és una candidata a fàrmac anticancerós que inhibeix la metàstasi de cèl·lules malignes de càncer de mama in vivo i ha sigut caracteritzada com un inhibidor potent de les Rho GTPases Rac i Cdc42. Aquests enzims presenten una activitat molt incrementada en diferents tipus de càncer i promouen la migració cel·lular, invasió, proliferació i transformació oncogènica. MBQ-167 inhibeix ambdues GTPases, amb una concentració responsable del 50% de la capacitat inhibitòria màxima (IC50) de 0.1 i 0.08 μM per a Rac i Cdc42, respectivament. Diferents assajos preclínics han demostrat que MBQ-167 inhibeix la migració cel·lular de cèl·lules malignes de càncer de mama, la seua viabilitat, el creixement del tumor (un 91% de reducció en la mida del tumor s’aconsegueix ja amb dos mesos de tractament) i la metàstasi in vivo sense una aparent toxicitat. Seguint una aproximació de modelat “middle-out”, els resultats del model PBPK després de la simulació de l’administració intraperitoneal (IP) de 10 mg/kg van posar de manifest la capacitat predictiva del model fisiològic no sols en la predicció dels paràmetres d’exposició AUC, Cmax i el temps en què s’arriba a la Cmax (Tmax) en plasma, sinó també en altres òrgans com cor, pulmons, fetge, melsa i ronyons, amb errors de predicció (Parampred/Paramobs) molt pròxims a la unitat i RE, en general, inferiors al 20%. El model de creixement tumoral (no pertorbat pel fàrmac) desenvolupat seguint l’estructura d’un model de Simeoni, descriu perfectament les dades experimentals de les dos línies cel·lulars estudiades (HER2+ i Triple Negativa), ja que el perfil simulat cau dins de l’interval de confiança al 95% (95CI) en tots els temps d’observació. Quan s’incorpora l’efecte d’MBQ-167 per a pertorbar el creixement tumoral, el model PBPK/PD també descriu les dades observades d’inhibició del creixement tumoral (TGI) en les dos línies cel·lulars. Concretament per a les cèl·lules HER2+, les simulacions del model prediuen amb una bona exactitud (RE<20%) la reducció del volum tumoral observat tant amb l’administració IP d’1 com de 10 mg/kg tres vegades per setmana durant 65 dies, amb una reducció del 94.3% amb el nivell de dosi més alt. En el cas de les cèl·lules Triple Negatives, el model desenvolupat va predir satisfactòriament la reducció en el creixement tumoral per al nivell de dosi d’1 mg/kg, mentre que les prediccions per al nivell de dosi més alt van resultar en un volum final lleugerament inferior a l’observat després d’administrar MBQ-167 tres vegades per setmana durant 108 dies. No obstant, la capacitat predictiva del model va estar confirmada ja que la dinàmica de creixement tumoral simulada va caure dins el 95CI de les observacions en els dos nivells de dosi i la predicció de la reducció del volum tumoral amb 10 mg/kg (89.6%) és molt pròxima a l’observada in vivo (87.0%). Verificada la capacitat predictiva del model PBPK/PD, es van realitzar una sèrie de simulacions per tal de respondre a les preguntes “Què passaria si MBQ-167 s’administrara una o dues vegades al dia en lloc de tres vegades per setmana? S’incrementaria la reducció de la mida del tumor amb pautes posològiques més intensives?” Els resultats d’aquestes simulacions va revelar que la reducció de la mida del tumor ( era major quan MBQ-167 s’administra una o dues vegades al dia, especialment per a la línia cel·lular HER2+, on l'erradicació del tumor podria anticipar-se administrant 1 mg/kg dues vegades al dia o 10 mg/kg una o dues vegades al dia. Per a la línia cel·lular Triple Negativa, l’efecte màxim s’aconsegueix ja amb 1 mg/kg, anticipant-se una estabilització del creixement tumoral quan MBQ-167 s’administra una o dues vegades al dia. -Part 3: modelat farmacocinètic fisiològic al context clinic -Avaluant interaccions entre fàrmacs i gens: el cas particular de l’ATS En aquesta part es dóna resposta als objectius específics 5 i 6 de la present tesi doctoral. L’atorvastatina (ATS) és una estatina sintètica de segona generació que s’administra en la forma àcida i farmacològicament activa de la salt càlcica (ATS-Ca). L’ATS és una de les estatines més utilitzades a nivell global per al tractament de la hipercolesterolèmia i conseqüent reducció del risc cardiovascular. La posologia d’ATS és l’administració diària d’un comprimit d’entre 10-80 mg en qualsevol moment del dia. Precisament, aquest és un dels principals avantatges d’aquesta estatina ja que, tant per la seua prolongada semivida biològica (t1/2) (14 h) com per l’existència de metabòlits actius (als quals s’atribueix un 70% de l’activitat inhibidora de l’enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzim A reductasa o HMG-CoA) no és necessari que l’administració d’aquest fàrmac tinga lloc de vesprada-nit, quan l’activitat d’aquest enzim responsable de la síntesi endògena de colesterol té una major activitat. A més a més, parlem d’un fàrmac ben tolerat i segur, essent l’efecte advers més freqüent (5-10%) la presència de miopaties o molèsties musculars. L’acumulació hepàtica de les estatines en general i de l’atorvastatina en particular, està mediada per estructures proteiques localitzades a les membranes basolaterals i canaliculars dels hepatòcits i que pertanyen a les famílies de polipèptids transportadors d’anions orgànics (OATP), polipèptids cotransportadors de taurocolat depenent de sodi (NTCP), i per transportadors de secreció activa depenent d’ATP (ABC). Estudis in vitro sobre la captació hepàtica d’ATS han demostrat que els transportadors OATP1B1 i OATP1B3 són els més rellevants, mentre que la contribució del transportador NTCP ha resultat minoritària per als processos de disposició d’aquesta estatina. Estudis en humans han posat de manifest que tant ATS com els seus metabòlits àcids són sensibles a polimorfismes en el gen SLCO1B1, ja que la concentració plasmàtica d’aquests va resultar ser superior en individus portadors de la variant al·lèlica SLCO1B1 521C (genotip T/C) al comparar-se amb la variant típica o “salvatge” 521 T/T. El metabolisme de l’ATS és un procés complex en el qual intervenen reaccions enzimàtiques de glucuronidació, lactonització, i oxidació. Tant ATS com els seus metabòlits àcids directes, 2-hidroxi-ATS (2OH-ATS) i 4-hidroxi-ATS (4OH-ATS), estan en equilibri amb les corresponents formes neutres lactonitzades (ATS-L, 2OH-ATS-L i 4OH-ATS-L). Aquest procés de lactonització (o formació d’un éster cíclic) pot tindre lloc espontàniament a un medi amb pH<6, o catalitzat per enzims pertanyents a la família d’UDP-glucuronosiltranferases (UGTs). El mecanisme de reacció proposat per aquesta lactonització enzimàtica és la formació d’un acil--D-glucurònid d’ATS, el qual experimenta un procés de ciclació espontània prèvia pèrdua del grup glucurònid. El procés contrari, és a dir, la hidròlisi de la lactona per obrir la molècula i tornar a donar la forma àcida i farmacològicament activa, té lloc espontàniament en medis amb pH>6 o pot estar catalitzada per esterases i paraoxonases plasmàtiques. És per això que ambdós processos (lactonització i hidròlisi) han de tenir-se en compte a l’hora de desenvolupar models farmacocinètics fisiològics per a l’ATS. El procés d’oxidació a través del citocrom P450 (CYP450) està considerat com la ruta majoritària per a la biotransformació d’estatines en la espècie humana, essent l’isoenzim CYP3A4 el més rellevant en el cas de l’ATS. Amb diferents afinitats i velocitats de reacció, aquests processos enzimàtics mediats pel CYP450 estan clarament polaritzats cap a les formes lactonitzades, essent més eficient l’oxidació d’ATS-L que la d’ATS. És a dir, el procés de lactonització d’ATS canvia la preferència del CYP450, essent molt més actiu sobre les formes neutres lactonitzades que sobre les formes àcides. El model PBPK desenvolupat a la plataforma Simcyp® V19 va descriure adequadament l’exposició a ATS, ATS-L, 2OH-ATS-L i 4OH-ATS-L després de la simulació d’una dosi única per via oral d’un comprimit d’ATS-Ca de 20, 40 o 80 mg i després de la simulació de l’administració diària de 10 mg d’ATS-Ca durant una setmana. Un aspecte important a tindre en compte és que, degut a limitacions intrínseques a la plataforma Simcyp® V19, únicament es va considerar el procés de lactonització enzimàtica mediada per UGTs. La lactonització presistèmica pel baix pH de l'estómac no es va poder implementar com a via paral·lela de l’actonització per limitacions estructurals de la plataforma Simcyp. És per això, que el model desenvolupat no contempla processos d’absorció d’ATS-L, ja que la seua formació és, en tot moment, sistèmica. De la manera com s’ha descrit en altres treballs d’investigació, el mecanisme principal per a la formació dels metabòlits hidroxilats 2OH-ATS i 4OH-ATS és la lactonizació d’ATS, hidroxilació d’ATS-L pel CYP450 i hidròlisi final dels metabòlits lactonitzats. No obstant això, la hidroxilació directa d’ATS pel CYP450 també està activa i funciona de manera paral·lela a aquesta ruta principal, encara que contribuint de manera minoritària al procés global d’eliminació d’aquesta estatina. És per això que la simulació de l’exposició a 2OH-ATS no va poder ser reproduïda adequadament pel model desenvolupat, amb errors de predicció de 0.57 per a AUC i 0.33 per a Cmax, a l’agarrar els factors d’extrapolació entre sistemes validats per al sistema in vitro en el que es van determinar les cinètiques de metabolisme per a cada isoforma del CYP450. La capacitat predictiva del model desenvolupat es va verificar mitjançant la simulació de les DDIs observades en el context clínic amb inhibidors del CYP450 (itraconazol i claritromicina) i d’OATPs (rifampicina). Com que en tots els escenaris considerats l’error de predicció en la variació d’AUC i Cmax com a conseqüència de la interacció farmacocinètica resultaren entre 0.66 i 1.45, tant l’estructura de les reaccions metabòliques proposada com la contribució relativa de cadascun dels transportadors de captació activa a l’interior dels hepatòcits (OATP1B1 (53.2%) > OATP1B3 (37.8%) >> OATP2B1 (9%)) va estar confirmada. Analitzant l’impacte de l’activitat de l’OATP1B1 sobre l’aclariment, AUC i Cmax d’ATS, les simulacions dutes a terme van revelar que aquells individus portadors d’una variant d’aquest transportador poc activa (PT), codificada pel polimorfisme SLCO1B1*5, presentaven una disminució en l’aclariment d’ATS del 30% (p<0.01) respecte a individus amb la variant típica o “salvatge” (ET). Com a conseqüència, l’AUC i la Cmax en aquests individus estava incrementada en un 40% (p<0.05) i un 33% (p<0.05), respectivament. A més a més, les prediccions del model PBPK revelaren que un 34.8% dels individus simulats tindrien un aclariment aparent d’ATS inferior a 414.67 L/h, valor que s’ha determinat com a mínim per baix del qual s’incrementa el risc de patir efectes adversos a nivell muscular. Entre aquests individus, els més afectats serien els PT, ja que el 63% estaria en risc de patir miopaties; com era d’esperar, el nombre d’individus en risc va disminuir de manera inversa a l’activitat del transportador OATP1B1 (transportadors intermitjos (IT), 42%; ET, 32%; transportadors ultraràpids (UT), 21%). Quantitativament, els individus amb un major risc de patir molèsties musculars per presentar un aclariment aparent d’ATS inferior a 414.67 L/h tindrien una exposició major tant a ATS (220%, p<0.0001) com a ATS-L (176%, p<0.0001). Aquests resultats estan en consonància amb l’increment en el risc de patir miopaties que s’ha observat en el context de la pràctica clínica diària per a pacients portadors de la variant SLCO1B1*5 d’1.4 (95CI: 1.1-1.7, p=0.02) i que és causa d’interrupcions en el tractament hipolipemiant amb ATS. És més, les prediccions són coherents també amb l’increment observat en l’exposició a ATS-L (p<0.01) i la prolongació en la t1/2 per a ATS (p<0.01) que presenten els pacients amb miopaties respecte els que no refereixen molèsties musculars. D’aquesta manera, el model PBPK desenvolupat per a ATS i els seus metabòlits anticipa i quantifica una relació exposició-seguretat entre ATS i ATS-L i efectes adversos a nivell muscular. -Optimització de l’expressió i la cinètica de receptors i processos d’eliminació d’anticossos monoclonals terapèutics utilitzats en oncologia. Aquesta part inclou la resolució de l’objectiu específic 7 d’aquesta tesi doctoral. L’activació de receptors tirosina quinasa transmembrana és clau en la patogènesi de molts trastorns neoplàsics. La família de receptors del factor de creixement epidèrmic (EGFR) està constituïda per un grup de quatre receptors transmembrana involucrats en processos de transducció de senyals que regulen la diferenciació i el creixement cel·lular. Aquests receptors (EGFR/HER1/ErbB-1, HER2/ErbB-2/neu, HER3/ErbB-3 i HER4/ErbB-4) presenten un domini extracel·lular (ECD) voluminós que constitueix una oportunitat terapèutica excel·lent per a dirigir fàrmacs biològics racionalment dissenyats per a alterar els canvis estructurals desencadenats per la unió natural (encara que en aquest cas, patològica) de lligands interns i/o processos de dimerització, fent possible el concepte de “magic bullet” proposat per Paul Ehrlich ja al segle 19. -Modelat farmacocinètic fisiològic d’anticossos monoclonals dirigits a HER2 La sobreexpressió del receptor HER2 al teixit tumoral va ser incorporada als paràmetres del sistema del model PBPK aplicant un factor de 25 vegades l’abundància d’aquest als teixits sans (normals), ja que la concentració mitjana del receptor HER2 ha estat determinada en 1293.8 i 31656 pg/mg en teixits normals i tumorals, respectivament. El model de disposició del fàrmac mediada per la unió a la diana terapèutica o TMDD va estar caracteritzat per una concentració del receptor (Rmax) no alterada per la unió del fàrmac biològic, ja que ni pertuzumab (PTZ) ni trastuzumab (TTZ), els dos anticossos monoclonals (mAbs) escollits per a desenvolupar els corresponents models PBPK, indueixen la internalització del receptor com a conseqüència de la interacció farmacodinàmica. Degut a la falta de consens en l’impacte dels nivells circulants del domini extracel·lular d’aquest receptor (cHER2-ECD) sobre la farmacocinètica d’aquests mAbs, no es va incorporar cap procés de “shedding” (pèrdua del ECD) en el model PBPK. L’optimització de la constant de degradació (kdeg) del receptor HER2 en teixits i òrgans normals a un valor de 0.398 h-1 va proporcionar una parametrització correcta del model TMDD en particular, i del PBPK en general, per descriure amb exactitud i precisió la farmacocinètica de PTZ en diferents nivells de dosi, pautes posològiques i trastorns neoplàsics. Aquest procés de degradació accelerada del receptor HER2 en teixits normals quan es compara amb el teixit tumoral, és coherent amb treballs d’investigació previs on s’ha caracteritzat l’impacte que la sobreexpressió del receptor HER2 en un trastorn neoplàsic té sobre la maquinària d’endocitosi i transport intracel·lular implicada en la seua degradació i reciclatge, aparentment degut a una quantitat limitada d’aquests recursos cel·lulars. El nostre model prediu que la constant de velocitat de degradació al teixit tumoral és molt probablement 5 vegades inferior (0.079 h-1) que la que presenten els teixits sans. Aquests resultats, van també de la mà amb models matemàtics que han caracteritzat les rutes intracel·lulars d’aquest receptor i han suggerit que, la sobreexpressió del receptor HER2 desviaria el curs fisiològic d’entrada a l’endosoma per a la seua degradació cap a rutes de reciclatge i retorn a la membrana cel·lular a les cèl·lules tumorals. L’avaluació numèrica de la capacitat predictiva del model PBPK desenvolupat per a PTZ amb l’optimització de l’expressió i la cinètica del receptor HER2 va resultar satisfactòria, amb errors de predicció percentuals (PPE) inferiors al 15%. La parametrització del receptor HER2 va estar verificada amb el model PBPK per a TTZ, obtenint-se PPEs del 16% per AUC i del 7% per a Cmax. -Modelat farmacocinètic fisiològic d’anticossos monoclonals dirigits a EGFR En el cas del receptor HER1 o EGFR, es va desenvolupar un model PBPK per a cetuximab (CTX) amb la finalitat d’optimitzar i avaluar processos d’eliminació de fàrmacs biològics. Després d’afegir un aclariment sistèmic addicional de 0.033 L/h als processos de catabolisme proteic i als processos d’eliminació pel model TMDD, el model PBPK desenvolupat va descriure satisfactòriament l’evolució temporal de la concentració plasmàtica de CTX en una àmplia varietat d’esquemes de dosificació amb PPEs del 13% i del 10% per a AUC i Cmax, respectivament. El model va ser capaç també de predir adequadament la concentració vall o mínima en la majoria dels escenaris simulats, la que ha estat reconeguda com un paràmetre d’exposició important en la resposta al tractament. Aquest aclariment addicional afegit als processos d’eliminació de CTX pot ser degut a: 1) la unió al receptor FcRIIIA, 2) la unió al subcomponent C1q, i/o 3) als processos d’escissió proteolítica de la regió frontissa baixa per metaloproteinasses presents en la matriu tumoral. L'estratègia de modelat PBPK seguida, tindria dues aplicacions majoritàries en el context de la farmacologia clínica d’un programa de desenvolupament d’anticossos monoclonals terapèutics. En primer lloc, permet verificar i validar l’expressió i la cinètica del receptor (paràmetre del sistema i depenent de la malaltia), molt important en el desenvolupament de models prospectius de mAbs dirigits a la mateixa diana terapèutica. En segon lloc, verificada la capacitat predictiva del model PBPK, aquest es podria aplicar per a respondre preguntes de l’estil “què passaria si...?” i predir 1) la farmacocinètica en un escenari concret no avaluat, com ara diferents esquemes de dosificació per minimitzar efectes adversos, 2) la concentració local en un determinat teixit o òrgan, i 3) l’ocupació del receptor aconseguida amb un esquema de dosificació concret. --Conclusions 1. El programa PhysPK Biosimulation Software ha sigut validat satisfactòriament prenent NONMEM com a referència per avaluar l’exactitud i la precisió dels resultats. 2. Els models PBPK amb una aproximació acausal, multinivell i orientada a objectes permeten descriure l’evolució temporal de l’exposició sistèmica a un fàrmac considerant de manera independent els components de simulació i les funcions matemàtiques del sistema fisiològic. 3. El comportament farmacocinètic i l’activitat antitumoral sobre les línies cel·lulars de càncer de mama HER2+ i Triple Negativa de la molècula candidata a fàrmac anticancerós MBQ-167 han sigut descrites i adequadament caracteritzades desenvolupant un model PBPK/PD. 4. La simulació de l’administració intraperitoneal de 10 mg/kg una o dues vegades al dia anticipa l'eradicació del tumor HER2+ i l’estabilització del creixement per a la línia cel·lular Triple Negativa. 5. El model PBPK de l’atorvastatina descriu l’evolució temporal d’aquest fàrmac i els seus metabòlits tant en forma àcida com lactonitzada. L'avaluació de la capacitat predictiva del model mitjançant la simulació de les interaccions farmacocinètiques observades en clínica verifica l’esquema metabòlic i de transport actiu proposat. 6. L’avaluació quantitativa de la interacció amb polimorfismes al gen SLCO1B1 ha posat de manifest que el 63% de pacients portadors de la variant SLCO1B1*5 tindrien un risc elevat de patir efectes adversos musculars. 7. L’optimitzacio de l’abundància i la cinètica de dianes terapèutiques, així com dels processos d’eliminació de fàrmacs biològics mitjançant el modelat PBPK, ha posat de manifest el potencial d’aquesta tècnica en el procés de descobriment i desenvolupament de fàrmacs orientat per models